Studien > Prof. Dr. Brigitte König – Eine in-vivo / ex-vivo / in-vitro Pilotstudie – Beeinflussung von klinisch-chemischen Parametern und von Mitochondrienfunktion peripherer Blutleukozyten durch Klein’sche Felder

in-vitro Pilotstudie – Beeinflussung von klinisch-chemischen Parametern und von Mitochondrienfunktionen peripherer Blutleukozyten (PBMC)
MMD GmbH & Co. KG / Prof. Dr. Brigitte König – Eine in – vivo / ex – vivo / in – vitro Pilotstudie – Beeinflussung von klinisch – chemischen Parametern und von Mitochondrienfunktionen peripherer Blutleukozyten (PBMC) durch Klein sche Felder Magnetstreifen 25 .11.2014
Seite 2 von 28 in – vitro Analyse mit peripheren Blutleukozyten ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 6 Fragestellung ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 6 Methodik ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 6 Zusammenfassung ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 9 Ergebnisse ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 9 klassische Klinisch – chemische Parameter ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 9 Probandin E.K. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 11 Proband H.T. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 11 Proband R.B. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 12 Proband B.K. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 12 Probandin P.T. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 12 Weitere klinisch – chemische Parameter ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 13 Klinische Parameter ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 14 Indirekte Mitochondrienparameter ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 15 Direkte Mitochondrienparameter ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 16 Verhältnis mitochondrialer DNA:nukleärer DNA / Mitochondrienmasse ………………………….. …………. 17 Rate mutierter mitochondrialer DNA (MtDNA,delta4766) ………………………….. ………………………….. … 18 PGC – 1 – alpha Expression in PBMC vor und nach Therapie ………………………….. ………………………….. …. 19 Nrf – 2 Expression in PBMC vor und nach Therapie ………………………….. ………………………….. …………… 19 Direkte Mitochondrienparameter nach Stimulation mit dem Stressor H2O2 ………………………….. ………….. 20 mitochondriales ATP ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 20 individuelle PGC – 1 – alpha, Nrf – 2, Rhoda nese Expression unter Zugabe des Stressors H2O2 in unterschiedlichen Konzentrationen ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 21 Proband P.T. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 22 Proband E.K. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 23 Proband H.T. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 25 Proband B.K. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 26 Proband R.B. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 27
Seite 3 von 28 Abbildung 1: anti – ox – LDL Antikörper im Serum vor und nach der Therapie. ………………………….. …………………… 13 Abbildung 2: ox – LDL im Serum vor und nach der Therapie. Referenzwert 95,3+/ – 37,9 ng/ml ………………………. 13 Abbildung 3: Thiolstatus im Serum vor und nach der Therapie. ………………………….. ………………………….. ……….. 14 Abbildung 4: Dokumentation der Oberflächenvenen vor und nach der Therapie bei der Probandin P.T. ……….. 14 Abbildung 5: M2 – PK im Serum vor und nach der Therapie. Referenzbereich <15 U/ml; Graubereich 15 – 25 U/ml ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 15 Abbildung 6: % LDH Isoenzym 4 vom Ge samt – LDH Wert. ………………………….. ………………………….. ………………… 16 Abbildung 7: % LDH Isoenzym 5 vom Gesamt – LDH Wert. ………………………….. ………………………….. ………………… 16 Abbildung 8: Einfluss der Therapie auf das Verhältnis mitochondrialer DNA : nukleärer DNA ………………………. 17 Abbildung 9: Einfluss der Therapie auf die Mitochondrienzahl ( gemessen an 50000 PBMC) dargestellt als n – facher Anstieg der Mitochondrien pro Zelle durch die Therapie. ………………………….. ………………………….. …….. 18 Abbildung 10: Einflu ss der Therapie auf Bildung/Eradikation der mitochondrialen Mutation delta4977 dargestellt als das Verhältnis mutierter mitochondrialer DNA (mtDNA) auf eine Kopie nukleärer DNA. ………… 18 Abbildung 11: Einfluss der Therapie auf die Expression von PGC – 1 – alpha in PBMC (gemessen a n 500000 peripheren Blutleukozyten). Die Werte sind dargestellt als N – fache Steigerung der Expression von PGC – 1 – alpha nach Therapie im Vergleich zu der PGC – 1 – alpha – Expression vor der Therapie. ………………………….. ………………. 19 Abbildung 12: Einfluss der Therapie auf die Expression von Nrf – 2 in PBMC (gemessen an 500000 peripheren Blutleukozyten). Die Werte sind dargestellt als N – fache Steigerung der Expression von Nrf – 2 nach Therapie im Vergleich zu der Nrf – 2 – Expression vor der Therapie. ………………………….. ………………………….. ……………………… 20 Abbildung 12: Einfluss der Therapie auf die Bildung von mitochondrialem ATP in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von 0,00005% H 2 O 2 . Die Werte sind dargestellt als prozentualer Anteil des ATP Gehaltes zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ………………………….. ……………………… 21 Abbildung 13: Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin P.T. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 22 Abbildung 14: Einfluss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin P. T. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ……… 22 Abbildung 15: Einfluss der Therapie auf die Rhodanase Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin P.T.. Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Rhodanase im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) 23 Abbildung 16: Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin E.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 23
Seite 4 von 28 Abbildung 17: Einfluss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedene n H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin E.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ……… 24 Abbildung 18: Einfluss der Therapie auf die Rhodanase Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin E.K.. Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Rhodanase im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) 24 Abbildung 19: Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei dem Probanden H.T. Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 25 Abbild ung 20: Einfluss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin H.T. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur K ontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ……… 25 Abbildung 21: Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 periph eren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin B.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 26 Abbildung 22: Einflu ss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin B.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ……… 26 Abbildung 23: Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin R.B. . Die Werte sind dargestellt al s n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 27 Abbildung 24: Einflu s der Therapie auf die N rf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin R.B.. Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 1 00%) ……… 27
Seite 5 von 28 Tabelle 1: Eckdaten der freiwilligen Probanden vor Beginn der Therapiestudie (Beginn zwischen 03.06.2014 und 01.07.2014) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 7 Tabelle 2: Eckdaten der freiwilligen Probanden am Ende der Studie (23.09.2014) ………………………….. …………… 8 Tabelle 3: Alle gemessenen klinisch – chemische Parameter ohne signifikanten Veränderungen / Verbesserungen ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 10 Tabelle 4: Proband E. K.; 23.06.1932, weiblich ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 11 Tabelle 5: Proband H. T.; 21.06.1942, männlich ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 11 Tabelle 6: Proband R. B.; 24.01.1958, männlich ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 12 Tabelle 7: Proband B. K.; 01.11.1959, weiblich ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 12 Tabelle 8: Probandin P. T.; 16.06.1974, weiblich ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 12
Seite 6 von 28 IN – VITRO ANALYSE MIT PE RIPHEREN BLUTLEUKOZY TEN FRAGESTELLUNG Die Verwendung von Klein sche Felder Magnetstreifen in der therapeutischen Anwendung hat bisher zumindest subjektiv bei zahlreichen Patienten gemäß derer vorliegenden Eigenerfahrungsberichten zu Verbes serungen des klinischen Krankheitsbildes gebracht , wie Verbesserungen des Schl afverhaltens, Reduzierung von multiplen Schmerzzust ä nden (degenerativer orthop ä discher Erkrankungen, Polyneuropathie), Parkinson, Ersch ö pfungszust ä nden, Ti n nitus, Reduktion kapillarer und lymphatischer Stauungen und somit Verbesserung der Mikrozirkulation . Der Mechanismus ist nicht gänzlich bekannt, eine direkte und/oder indirekte Wirkung u. a. auf die Mitochondrienfunktionen wird angenommen . Diese Annahme beruht neben gängigen Überlegunge n auch auf eine zuvor durchgefü hrte in vitro – Studie. Bei dieser kam es unter Einfluss der Kleinsche Felder u.a. zu einer Steigerung der mitochondrialen ATP – Bildung nebst Erhöh ung der Bildung von PGC – 1 – alpha . Diese und andere eventuelle Effekte sollten nun in vivo geprüft werden. Die übergeordnete n Fragestellung en dieser in – vivo / ex – vivo / in – v itro Studie mit 5 Probanden lassen sich folgendermaßen formulieren: Hat die Anwendung der Kleinsche Felder Magnetstreifen positive Auswirkungen auf den Gesundheitsstatus ? Sind Einflüsse der Kleinsche Felder Magnetstreifen auf den menschlichen Organismus nur subjektiv oder /und objektiv zu erfassen ? Im Detail sollten folgende Fragen beantwortet werden: Werden klinisc h – chemische Parameter beeinfluss t ? Werden und die Mitochondrien parameter peripherer Blutleukozyten (PBMC) beeinflu ss t ? METHODIK Es wurde n 5 freiwillige Probanden ausgewählt. Die Eckdaten der Patienten vor Therapie und nach Therapie sind in der Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. Bei dieser „proof – of – principle“ Studie hatten die Probanden eine Schlafa uflage mit Kleinsche Felder (System ohne Strom) auf ihrer Schlafm atratze aufgelegt . Darüber wurde nur ein Bettlaken gelegt. Ein Proband verwendete neben der Schlafauflage auch die Sit zauflage. Der Lebensstil und die Essgewohnheiten wurden während dieser Zeit nicht geändert. Ebenso fand keine Substitution mit Nahrungs e r gänzungsmitteln bzw. Therapeutika statt. Die gesamten Laboruntersuchungen wurden unmittelbar vor Beginn der Therapie (S chlafen auf der Auflage) und 3 Monate nach Therapie mit Klein sche Felder monotherapeutisch durchgeführt. Den Probanden wurde vor Beginn der Studie und nach der Studie Blut entnommen und unter sucht. Die Behandlung mit Kleinsche Felder wurde für die Dauer vo n 3 Monaten festgelegt. Das Blut wurde a) für die Bestimmung klassischer klinisch – chemischer Parameter (CST – Profil) und b) für die Isolierung peripherer Blutleukozyten (PBMC) und der Mitochondrien verwendet. Die Analysen wurden a) direkt nach ihrer Isolie rung durchgeführt; b) nach 24 Stunden Inkubation in der Anwesenheit von dem Stressor H 2 O 2 . Als Untersuchungsparameter wurden gewählt: 1) Das Verhältnis mitochondrialer DNA zu nukleärer DNA; 2) das Vorhandensein der mitochondrialen delta 4977 Mutation; 3) die mitochondriale ATP Bildung.
Seite 7 von 28 Tabelle 1 : Eckdaten der freiwilligen Probanden vor Beginn der Therapiestudie (Beginn zwischen 03.06.2014 und 01.07.2014) Kürzel Geschlecht Geb. Datum Erkrankungen / Diagnosen / pers. Empfinden E.K. W 23.06.1932 Darmkrebs vor 5 Jahren, Post – Chemo Polyneuropathie in Fingern, Füßen und Beinen seit Chemo vor 5 Jahren, Schlafstörung, melancholisch – depressive Störung, Nierenarterienstenose mit Kreatininerhöhung, BMI :26 H.T. M 21.06.1942 Übergewicht, Diabetes, Bluthochdruck, postoperative Wundhe ilungs s törungen (Entfernung von 2 Rippen nach endogenen Rippenbrüchen, massive Dauerschmerzen , „sieht aus und fühlt sich wie Häuflein Elend“ BMI: 30 R.B. M 24.01.1958 Chronisch „verspannt“ im HSW/Schulterbereich, hochgradig allergisch, Vitiligo, Autoimmunerkrankung der Schilddrüse (Medikamenteneinnahme) BMI: 26 B.K. W 01.11.1959 Besenreiser, gelegentlich Durchschlafstörungen (nach 2 Stunden Schlaf stundenlanges Wachliegen), Schlafstörung mit Tachykardie bei Vollmond BMI: 19 P.T. W 16.06.1974 Übergewichtig, verhärtete Venenkonglomerate (dunkelblau), „schwere“ Beine, Besenreiser, „schlechter“ Schlaf BMI: 27
Seite 8 von 28 Tabelle 2 : Eckdaten der freiwilligen Probanden am Ende der Studie (23.09.2014) Kürzel Geschlecht Geb. Datum Erkrankungen / Diagnosen / pers. Empfinden E.K. W 23.06.1932 Darmkrebs vor 5 Jahren, Post – Chemo Polyneuropathie in Fingern, Füßen und Beinen seit Chemo vor 5 Jahren, Schlafstörung, melancholisch – depressive Störung, Nierenarteri enstenose mit Kreatininerhöhung, BMI :26 Polyneuropathie gänzlich verschwunden H.T. M 21.06.1942 Übergewicht, Diabetes, Bluthochdruck, postoperative Wundheilungs s törungen (Entfernung von 2 Rippen nach endogenen Rippenbrüchen, massive Dauerschmerzen „sieht aus wie Häuflein Elend“ BMI: 30 Blutzuckerwerte normalisiert, Bluthochdruck „im Griff“ (von 180/120 auf 140/80), Wundheilung „im Griff“ (Wunde jetzt verschlossen, keine Schmerzen) , sieht aus wie das „blühende Leben“ R.B. M 24.01.1958 Chronisch „verspannt“ im HSW/Schulterbereich, hochgradig allergisch, Vitiligo, Autoimmunerkrankung der Schilddrüse BMI: 26 Empfindet k eine subjektiven Veränderung en B.K. W 01.11.1959 Besenreiser, gelegentlich Durchschlafstörungen (nach 2 Stunden Schlaf stundenlanges Wachliegen), Schlafstörung mit Tachykardie bei Vollmond BMI: 19 Schlafstörung und Tachykardie bei Vollmond behoben. Generell tiefer und erholsamer Schlaf P.T. W 16.06.1974 Übergewichtig, verhärtete Venenkonglomerate (dunkelblau), „schwere“ Beine, Besenreiser, „schlechter“ Schlaf . BMI: 27 Venenkonglomerate sind weich, keine schweren Beine
Seite 9 von 28 ZUSAMMENFASSUNG Insgesamt zeigen die Ergebnisse , dass die Benutzung von Klein sche Felder Magnetstreifen als Schlafauflagen s ubjektiv einen positiven Einfluss auf das Gesundheitsempfinden fast aller Probanden (4 von 5) hatte. Dieses subjektive Empfinden kann durch die gemessenen Veränderungen durch bekannte spezifische und individuelle klinisch – chemische Parameter nicht, höchstens ansat zweise oder nur teilweise erklärt werden. Einige Veränderungen von klinisch – chemischen Parametern widersprechen nach allgemeiner Auffassung sogar dem subjektiven Empfinden einer gesundheitlichen Besserung (gemessene Parameter in Tabelle 3). Es konnten all erdings Veränderungen indirekter und insbesondere direkter Mitochondrienparameter festgestellt werden, die auf eine positive Auswirkung auf die Gesundheit schließen lassen. Diese waren nach 3 monatiger Monotherapie mit Klein sche Felder Magnetstreifen u. a. insbesondere Eine Zunahme der Mitochondrienmasse in den peripheren Blutleukozyten (PBMC) Zunahme des Verhältnisses mitochondrialer DNA zu Zellkern – DNA Verminderter Nachweis von Mitoc hondrien mit der Deletionsmutation delta4977 in den PBMC Zunahme der Basis PGC – 1 – alpha Produktion in den PBMC Veränderte Expression der LDH Isoenzym e 4 und 5 Steigerung der Resistenz gegenüber Stressoren. Aufrechterhaltung der ATP Produktion nach H 2 O 2 Stimulation Insgesamt lassen die Daten den Schluss zu, dass die Benutzung von Klei nsche Felder Schlafauflagen einen positiven Einfluss auf die Mitochondrien und deren Funktionen ausübt. Die vorliegenden Ergebnisse sollten allerdings nur wegweisend bewertet werden. Um eine allgemeingültige Wirkung auf eine oder mehr ere Mitochondrienfunktionen postulieren zu können, müssen die gewonnenen Ergebnisse durch Untersuchungen bei weiteren Probanden / Patienten bestätigt werden. Auch sollten die bedeutendsten Ergebnisse durch ergänzende Methoden abgesichert werden. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich um fest zustellen, a) in welc hem Maße und wie weit die Kleinsche Felder Magnetstreifen die Mitochondrien funktionsfähiger machen, b) bei welchem Patientenklientel die besten kurzfristigen Erfolge zu erzielen sind; c)ob durch begleitende Gabe von Therapeutika ein synergistischer Effekt erzielt werden kann. Es ist ebenfalls zu berücksichtigen, da ss z. B. Reparaturvorgänge und mitochondriale Neusynthese dynamische Prozesse sind und daher zeitlichen Schwankungen unterlieg en. ERGEBNISSE Im Folgenden sind die Ergebnisse aller 5 Probanden zusammengestellt. KLASSISCHE KLINISCH – CHEMISCHE PARAMETER Alle gemessenen klinisch – chemischen Parameter ohne signifikante Veränderungen am Ende der T estphase im Vergleich zum Beginn der Testphase sind in der Tabelle 3 zusammen gestellt. Zur Verdeutlichung der Ergebnisse sind exemplarisch einige Parameter vor und nach der Testphase für jeden Probanden i n den
Seite 10 von 28 Tabellen 5 – 9 aufgeführt. Diejenigen klinisch – chemischen Parameter, die sich klinisch bzw. therapeutisch relevant verändert haben (nur Probandin E.K.) , sind mittels Pfeil markiert. In den Abbildungen1 bis 4 sind die Werte für anti – ox – LDL – Antikörper und den Thiolstatus für die Probanden zusammen gefas st. Die Ergebnisse untermauern, dass die Probanden insbesondere ihre Essgewohnheiten nicht verändert haben u nd demnach nicht mit einer Verbesserung der klassischen Klinisch – chemischen Parameter gerechnet wurde. Bei der Probandin E.K. mit bekannter Nierenarterienstenose hat sich der Kreatininwert signifikant verbessert . Dies ist sicherlich auf eine besse re Durchblutung durch die Kleinsche Felder begründet. Bei dem Probanden H.T. hat sich nach Aussage des Hausarztes zudem der Nüchternglu kosespiegel normalisiert und der Blutdruck ließ sich stabil einstellen . Die Verläufe für anti – ox – LDL – AK, ox LDL, und den Thiolstatus erklären die positiven Verläufe bei den Probanden nicht , scheinen diesen sogar teilweise zu widersprechen . Die anti – o x – LDL – Antikörper, ein früher Marker für o xidative n Stress, sind sogar bei 4 Probanden angestiegen , oxidiertes LDL bei 2 von 5, parallel dazu hat sich der Thiolstatus (ant ioxidativer Kapazitätsparameter ) bei 3 von 5 Patienten verbessert . Tabelle 3 : Alle g emessene n klinisch – chemisc he Parameter ohne signifikante n V eränderungen / Verbesserungen Parameter Hämatologischer Status Differenzialblutbild Anämiediagnostik Vitamin D3 Mineralien Nierenstoffwechsel (außer Patientin E.K.) Herz/Leber/Galle/Pankreas Fettstoffwechsel Schilddrüse Melatonin Serotonin Anti – ox – LDL – Antikörper ox – LDL Sulfhydrylstatus
Seite 11 von 28 PROBANDIN E.K. Tabelle 4 : Proband E. K.; 23.06.1932, weiblich PROBAND H.T. Tabelle 5 : Proband H. T.; 21.06.1942, männlich
Seite 12 von 28 PROBAND R.B. T abelle 6 : Proband R. B.; 24.01.1958, männlich PROBAND B.K. Tabelle 7 : Proband B. K.; 01.11.1959, weiblich PROBANDIN P.T. Tabelle 8 : Probandin P. T.; 16.06.1974, weiblich
Seite 13 von 28 WEITERE K LINISCH – CHEMISCHE PARAMETER Abbildung 1 : anti – ox – LDL Antikörper im Serum vor und nach der Therapie. Abbildung 2 : ox – LDL im Serum vor und nach der Therapie. Referenzwert 95,3+/ – 37,9 ng/ml
Seite 14 von 28 Abbildung 3 : Thiolstatus im Serum vor und nach der Therapie. KLINISCHE PARAMETER Bei der Probandin P.T. wurden nach d er Therapie ihre dicken und verhärteten Venen weich er tastbar. Abbildung 4 : Dokumentation der O berflächenvenen vor und nach der Therapie bei der Probandin P.T.
Seite 15 von 28 I NDIREKTE MITOCHONDRI ENPARAMETER Im folgenden Schritt wurde analysiert, ob sich die indirekten Mitochondrienparameter, insbesondere die LDH – Isoenzyme und die M2PK als Entzündungsmarker und Marker de r Mitochondrienumstrukturierung ändern. Die Serum – M2PK hat sich bei den Probanden teilweise erh ö ht, teilweise erniedrigt und erkl ä rt somit nicht den positiven Verlauf der Probanden. Möglicherweise sind der Anstieg im Rahmen aktivierter und noch notwendiger Zellteilungs – und Rep a raturprozesse zu diskutieren . So ist z. B. bei Patient E.K. ein M2PK – Anstieg bei parallel stattgefundener Verbesserung der Nierenfunktion bei Nierenarteriosklerose mit Normalisierung des Kreatininwertes erkennbar . Der prozentuale Anteil des LDH – Isoenzym es 5 am Gesamt – LDH gemessen hat sich bei 3 von 5 Probanden reduzie rt . Dies deutet auf einen Einfluss der Klein sche Felder auf die Mitochondrien hin . Auffallend sind die signifikanten Verbesserungen von M2PK und LDH 4 – und – 5 des Probanden H.T. Er war der einzige Proband, welcher nachts auf der Schlafauflage schlief und tagsüber auf der Sitzauflage saß. Im Gegensatz dazu hat sich bei Patientin E.K. das LDH – Isoenzym 5 nicht verbessert und somit ist d ie Reduktion des Kreatinwertes und die Nierenfunktionserbesserung der Patientin E.K . nicht durch diese n Parameter zu erkläre n. Abbildung 5 : M2 – PK im Serum vor und nach der Therapie. Referenzbereich <15 U/ml; Graubereich 15 – 25 U/ml
Seite 16 von 28 Abbildung 6 : % LDH Isoenzym 4 vom Gesamt – LDH Wert. Abbildung 7 : % LDH Isoenzym 5 vom Gesamt – LDH Wert. DIREKTE MITOCHONDRIE NPARAMETER Im Folgenden wurden aus dem Vollblut periphere Blutleukozyten (PBMC) isoliert. Diese wurden direkt auf folgende Parameter hin analysiert: 1) Bestimmung des Verhältnis s es mtDNA:ntDNA (Anzahl mitochondriale DNA im Verhältnis zu Anzahl Zellkern DNA ; 2) Bestimmung der mitochondrialen Mutation delta – mtDNA4977 (hot spot) . Des Weiteren wurden die periphere n Blutleukozyten ( PBMC ) für weitere 24h in der Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen an H 2 O 2 (Wasserstoffperoxid) als Stressor inkubiert. Danach wurde das mitochondrial generierte ATP, die PGC – 1 – alpha , Nrf – 2 und Rhodanase Expression analy siert.
Seite 17 von 28 VERHÄLTNIS MITOCHOND RIALER DNA :NUKLEÄRER DNA / MITOCHONDRIENMASSE Im Folgenden sind die Ergebnisse dargestellt, die direkt nach Isolierung der periphere n Blutleukozyten ( PBMC ) gewonnen wurden. Die Ergebnisse für das Verhältnis der Anzahl mitochond rialer DNA zu nukleärer DNA sind in Abbildung 9 dargestellt. In Abbildung 8 ist der Einflu ss der Therapie als Steigerung der Mitochondrienmasse ausgedrückt. Da sich d as Verhältnis mitochondrialer zu nukleärer DNA (mtDNA:ntDNA) immer auf dieselbe Anzahl an PBMC bezieht, ist ein Anstieg des Verhältnisses mtDNA:ntDNA nur mit einer Neusynthese von Mitochondrien zu erklären. Daher zeigen d ie Ergebnisse (Abbildungen 9 und 10) , dass durch Klein sche Felder Magnetstreif en es zu einer signifikanten Neusynthese von Mitochondrien und somit Massenzunahme der Mitochondrien kommt , auch wenn diese bei den Probanden individuell unterschiedlich ausfällt. Im Mittel kamen v or der Therapie 222,03 Kopien mitochondrialer DNA auf 1 Kopie Zellkern DNA, n ach der Therapie mit Klein sche Felder Magnetstreifen ist die Anzahl mitochondrialer DNA auf 1 Kopie Zellkern DNA im Mittelwert auf 2212,08 und somit den Faktor 9,96 gestiegen. A bbildung 8 : Einflu ss der Therapie auf das Verhältnis mitochondrialer DNA : nukleärer DNA
Seite 18 von 28 Abbildung 9 : Einfluss der Thera pie auf die Mitochondrienzahl ( gemessen an 50000 PBMC) darges tellt als n – fac her Anstieg der Mitochondrien pro Zelle durch die Therapie. RATE MUTIERTER MITOCHONDRIALER DNA (MTDNA,DELTA4766 ) Im Folgenden sind ebenfalls die Ergebnisse dargestellt, die direkt nach Isolierung der peripheren Blutleukozyten ( PBMC ) gewonnen wurden. Die Ergebnisse für den Anteil mutierter DNA ( delta4766 ) gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten vor und nach der Therapie sind in der Abbildung 11 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Reduktion der mitochondrialen de lta 4977 Mutation durch die Therapie mit Klein sche Felder Magnetstreifen. Eine Erklärung dafür könnte die Eliminierung mutierter Mitochondrien mit nachfolgender N eusynthese von Mitochondrien sein . Abbildung 10 : Einflu ss der Therapie auf Bildung/Eradikation der mitochondrialen Mutation delta4977 dargestellt als das Verhältnis mutierter mitochondrialer DNA (mtDNA) auf eine Kopie nukleärer DNA.
Seite 19 von 28 P GC – 1 – ALPHA EXPRESSION IN PBMC V OR UND NACH THERAPIE Es wurde analysiert o b sich die Basis PGC – 1 – alpha Expression in aus dem Blut isolierten PBMC vor und nach der Therapie untersche iden. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 11 dargestellt. Man erkennt individuell eine veränderte Basis PGC – 1 – alpha Expression der peripheren Blut leukozyten nach der Therapie. Die Absolutwerte an PGC – 1 – alpha Expression schwanken zwischen den individuellen Probanden . Die gesteigerte PGC – 1 – alpha Expression ist vor allem bei denjenigen Probanden auffällig, die einen starken Rückgang ihrer mutierten mitochondrialen DNA aufweisen. Abbildung 11 : Einfluss der Therapie auf die Expression von PGC – 1 – alpha in PBMC (gemessen an 5 0 0000 peripheren Blutleukozyten). Die Werte sind dargestellt als N – fache Steigerung der Expression von PGC – 1 – alpha nach Therapie im Vergleich zu der PGC – 1 – alpha – Expression vor der Therapie. NRF – 2 EXPRESSION IN PBMC V OR UND NACH THERAPIE Es wurde analysiert ob sich die Basis Nrf – 2 Expression in aus dem Blut isolierten PBMC vor und nach der Therapie untersche iden. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 12 dargestellt. Im Gegensatz zur PGC – 1 – alpha Expression liegen bei 3 von 5 Probanden die Nrf – 2 Expression nach der Therapie unterhalb der jenigen Expression vor der Therapie. 2 Probanden zeigen e in unveränderte Basisexpression von Nrf – 2 vor und nach der Therapie.
Seite 20 von 28 Abbildung 12 : Einfluss der Therapie auf die Expression von Nrf – 2 in PBMC (gemessen an 5 0 0000 peripheren Blutleukozyten). Die Werte sind dargestellt als N – fache Steigerung der Expression von Nrf – 2 nach Therapie im Vergleich zu der Nrf – 2 – Expression vor der Therapie. DIREKTE MITOCHONDRIE NPARAMETER N ACH STIMULATION MIT DEM STRESSOR H2O2 MITOCHONDRIALES ATP Die Abbildungen 1 2 zeig en für alle Probanden zus ammengefasst den Einflu ss des Stressors H 2 O 2 auf die mitochondriale ATP – Generierung vor und nach Therapie mit Klein sche Felder Magnetstreifen Nach der Therapie generieren die Mitochondrien der PBMC mehr ATP nach Zugabe des Radikals tressors Wasserstoff peroxid H 2 O 2 (Konzentration 0,0005 %) im Vergleich zu vor der Therapie. Somit haben die Mitochondrien der PBMC nach der Therapie eine höhere Kapazität, mitochondriales ATP unter Stress zu generieren
Seite 21 von 28 Abbildung 13 : Einfluss der Therapie auf die Bildung von mitochondrialem ATP in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von 0,000 05 % H 2 O 2 . Die Werte sind dargestellt als prozentualer Anteil des ATP Gehaltes zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) IND IVIDUELLE PGC – 1 – ALPHA, NRF – 2, RHODANESE EXPRESS ION UNTER ZUGABE DES STRESSORS H2 O2 IN UNTERSCHIEDLIC HEN KONZENTRATIONEN Im Folgenden werden für jeden Probanden der Einfluss der Therapiedauer mit den Kleinsche Felder auf die PGC – 1 – alpha – , Nrf – 2 und Rhodanas e Expression dargelegt. Die Analyse wurde an PBMC nach Zugabe des Stressors H 2 O 2 und Inkubation für weitere 24h bei 37°C unter 5% CO 2 durchgeführt. Entsprechend den Ergebnissen lasen sich die Probanden in 2 Gruppen einteilen: 1) Probanden mit einer gesteigerten PGC – 1 – alpha Expression am Therapieende nach Stimulation mit H 2 O 2 (5×10 – 4 ). Die relative Nrf – 2 und Rhodanase Expressionen orientieren sich an die PGC – 1 – alpha Expression. 2) Probanden mit einer verminderten PGC – 1 – alpha Expression am Therapiee nde nach Stimulation mit H 2 O 2 (5×10 – 4 ). Die relative Nrf – 2 und Rhodanase Expressionen orientieren sich an die PGC – 1 – alpha Expression.
Seite 22 von 28 PROBAND P.T. Abbildung 14 : Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin P.T. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) Abbildung 15 : Einfluss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von ve rschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der P robandin P.T. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%)
Seite 23 von 28 Abbildung 16 : Einfluss der Therapie auf die Rhodanase Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der P robandin P . T .. Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Rhodanase im Verglei ch zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) PROBAND E.K . Abbildung 17 : Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin E.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%)
Seite 24 von 28 Abbildung 18 : Einfluss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PB MC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin E.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) Abbildung 19 : Einfluss der Therapie auf die Rhodanase Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin E . K .. Die Werte sind dargestell t als n – fache Expression von Rhodanase im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%)
Seite 25 von 28 PROBAND H.T . Abbildung 20 : Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei dem Probande n H.T. Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergl eich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) Abbildung 21 : E influss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Pr obandin H.T. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%)
Seite 26 von 28 PROBAND B.K . Abbildung 22 : Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin B.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) Abbildung 23 : Einflu ss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von ve rschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin B.K. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%)
Seite 27 von 28 PROBAND R.B . Abbildung 24 : Einfluss der Therapie auf die PGC – 1 – alpha Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin R.B. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von PGC – 1 – alpha im Ver gleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%) Abbildung 25 : Einfluss der Therapie auf die Nrf – 2 Expression in PBMC (gemessen an 50000 peripheren Blutleukozyten) in der Anwesenheit von verschiedenen H 2 O 2 Konzentrationen bei der Probandin R.B. . Die Werte sind dargestellt als n – fache Expression von Nrf – 2 im Vergleich zur Kontrolle (ohne H 2 O 2 ; = 100%)
Seite 28 von 28 SCHLUSS FOLGERUNG Die Untersuchungen haben gezeigt, dass sich im Laufe der Therapie Mitochondrienparameter verändert haben, die auf eine Regeneration von Mitochondrien und deren Funktionssteigerung schließ en lassen. Der Abbau von schadhaften Mitochondrien, die Neusynthese v on Mitochondrien sowie eine Optimierung ihrer Funktionen sind ein komplexer Prozess. Entscheidende mitochondriale Parameter in diesem komplexen Prozess sind u. a. PGC – 1, Nrf – 2, die Rhodanase und die mitochondriale ATP – Bildung. Diese Parameter sind durch Si gnaltransduktionsketten miteinander verbunden und werden sowohl aktiviert wie auch deaktiviert. Die in dieser Studie durchgeführten Analysen sind nur eine Momentaufnahme von Prozessen, die bei jedem Individuum zudem unterschiedlich stark und zeitlich versc hoben ablaufen können. Daher ist eine Wertung über den Erfolg einer Therapie durch das Herausgreifen eines einzelnen Parameters nicht möglich. AKTUALISIERUNG DER BERICHTERSTATTUNG AM 21.12.2014 Die Probandin P.T. wendet seit Abschluss und abschließender Berichterstattung der Studie neben der Schlafauflage nun auch die Sitzauflage an und berichtet über ein zunehmendes Verschwinden der Krampfadern. Die Probandin E.K. (Nierenarterienstenose mit ursp rünglicher post – Chemo N europathie) hat überhaupt keine Besc hwerden mehr. Auch wenn bei dem Probanden R.B. noch keine subjektiven Verbesserungen eingetreten sind, zeigen dessen Werte gemäß Studie eine Verbesserung der zellulären Funktionen. Es ist erwiesen, dass zelluläre Funktionen zeitlich bereits Fehlfunktionen anzeigen bevor das persönliche Empfinden ein gesundheitliches Missempfinden signalisiert. Bei Patientin B.K. hat nach ca. 5 Monaten das Haarwachstum im Schläfenbereich deutlich zugenommen. Sie schläft hauptsächlich direkt mit dem Kopf auf der Schlafauflage ohne Kopfkissen oder nur auf einem "Zipfel" davon.