Studien > Jonas Heisterkamp – Beeinflussung der mitochondrialen Bioenergetik durch permanente polymorphe Magnetfelder – Klein’sche Felder I Otto – von – Guericke – Universität Magdeburg Bachelorarbeit Beeinflussung der mitochondrialen Bioenergetik durch permanente polymorphe Magnetfelder Jonas Heisterkamp Betreuer: Prof. Dr. Brigitte König Prof. Dr. Gerhard Jorch I Zusammenfassung In der Medizin werden seit langem Magnetfelder verschiedener Art zur Therapie unterschiedlicher Erkrankungen eingesetzt. Einen neuen Typen stellen hierbei permanente polymorphe Magnetfelder dar, die ohne Strom arbeiten. Aufgrund einer mosaikartigen abwechselnden Anordnung von Positiv – und Negativpolen entsteht ein inhomogenes Magnetfeld, das in der L age ist, mit beweglichen Strukturen innerhalb eines Organismus in Wechselwirkung zu treten. Beim Menschen sind dies vorrangig Körperflüssigkeiten wie etwa Blut oder Lymphe. Diese erfahren beim Vorbeifließen an der komplexen Polanordnung einen elektromagnet ischen Einfluss. Die Mitochondrien als „Kraftwerke der Zelle“ sind die Orte der Energieproduktion in menschlichen Zellen. Gerade in Immunzellen spielen Mitochondrien eine grundlegende Rolle bei zellulärer Aktivität, Proliferation und Differenzierung. Sch on seit einiger Zeit wird vermutet, dass eine Fehlfunktion der Mitochondrien und eine damit einhergehende Störung der ATP – Produktion sowohl Grundlage als auch Ergebnis vieler Erkrankungen sind . Zur Beurteilung des Gesundheitsstatus‘ von Mitochondrien wird bei medizinischen Untersuchungen der Bioenergetische Gesundheitsindex (BHI) herangezogen. Über verschiedene Größen der mitochondrialen Atmung kann so eine Aussage zum metabolische n Potent ial einer Zelle getroffen werden. In der vorliegenden Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob polymorphe permanente Magnetfelder in Form der Kleinschen Felder einen Einfluss auf die Bioenergetik von Mitochondrien ausüben. Als Zielzellen wurden dafür THP – 1 – Zellen sowohl als Suspensi ons – , als auch als PMA – differenzierte Zellen verwendet. Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche der Stimulation von menschlichen Immunzellen mit permanenten polymorphen Magnetfeldern zeigen, dass es einen Effekt der Kleinschen Felder auf die Mitochond rien gibt, der sich in der mitochondrialen Atmung widerspiegelt. Vielfach auftretende höhere Werte bei den stimulierten Zellen im Vergleich zu nicht – stimulierten Zellen gehen dabei auf eine gesteigerte Aktivität der Mitochondrien zurück. Die Ergebnisse las sen den Schluss zu, dass polymorphe permanente Magnetfelder einen Beitrag zur Steigerung des metabolischen Potentials von menschlichen Immunzellen leisten können. II Abstract The medicine has used magnetic fields of various types for a long time to treat dif ferent diseases. New types are persistent polymorphous magnetic fields without using power . Due to a mosaic – like alternating structure of positiv e and negativ e poles an inhomogeneous magnetic field is generated that is able to interact with motile structur es of an organism. In humans these structures are primarily body fluids like blood or lymph. When they flow past the sophisticated arrangement they get an electromagnetic influence. The mitochondrion as the ‘powerhouse of the cell’ is the place of energy production in human cells. Especially in immune cells the mitochondria are a basic part of cellular activity, proliferation and differentiation. For some while it is suspected that a dysfunction of mitochondria and a disorder of ATP production, which comes along with, are both basis and result of many diseases. In order to evaluate the health condition of mitochondria the Bioenergetic Health Index (BHI) is used as an indicator of cellular and mitochondrial health . Declarations about the metabolic potential of a cell can be made by different factors of mitochondrial respiration. In the present thesis it should be examined if polymorphous persistent magnetic fields in the form of Kleinsche Felder have an influence on the bioenergetics of mitochondria. THP – 1 – s uspension and PMA – differentiated THP – 1 – cells were used as target cells. The attempts performed in this thesis of stimulating human immune cells with persistent polymorphous magnetic fields show an effect of the Kleinsche Felder on the mitochondria, which c an be watched in the mitochondrial respiration. Multiply occurring high values of stimulated cells compared to non – stimulated cells trace back to an enhanced activity of mitochondria. These results lead to the conclusion that polymorphous persistent magnet ic fields can contribute to the increase of metabolic potential of human immune cells. III Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmitt el angefertigt habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Bachelorarbeit stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form als Bachelorarbeit eingereicht und ist als Ganzes auch noch nicht veröffentlicht. _______________________ Magdeburg, 2 9 .11. 2017 IV Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… I Abstract ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. II Eidesstattliche Erklärung ………………………….. ………………………….. ……………………… III Inhaltsverzeichnis ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… IV Abbildungsverzeichnis ………………………….. ………………………….. …………………………. VI Tabellenverzeichnis ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. X Abkürzungen ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. XIII Einheiten ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. XV 1. Einleitung ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 1 1.1. Kleinsche Felder ………………………….. ………………………….. ………………………. 3 1.2. Mitochondrien ………………………….. ………………………….. ………………………….. 3 1.3. Bioenergetischer Gesundheitsindex ………………………….. ………………………… 7 2. Material und Methoden ………………………….. ………………………….. …………………. 10 2.1. Materialien ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 10 2.2. Reagenzien und Medien ………………………….. ………………………….. ………….. 12 2.3. Geräte ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 13 2.3.1. Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience) ………………………….. ………… 14 2.3.2. Seahorse XFp Analyzer (Agilent Technologies) ………………………….. …. 15 2.4. Vorbereitungen für Untersuchungen von Zellen im Seahorse ………………… 15 2.5. Anzucht von Zellen aus der Kryokultur ………………………….. …………………… 18 2.6. Kultivierung un d Pflege der Zellen ………………………….. …………………………. 19 2.7. Stimulation der Zellen mit Magnetstreifen ………………………….. ………………. 20 2.8. Aufarbeitung der Zellen für Untersuchungen im Seahorse …………………….. 22 3. Ergebnisse ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 24 3.1. THP – 1 – Zellen ………………………….. ………………………….. …………………………. 24 V 3.1.1. Vorversuch ………………………….. ………………………….. ………………………. 24 3.1.2. 1h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 29 3.1.3. 4h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 35 3 .1.4. 8h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 41 3.1.5. 24h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………… 47 3.1.6. Kinetik der mitochondrialen Atmung ………………………….. ………………… 54 3.2. PMA – differenzierte Zellen ………………………….. ………………………….. ………… 56 3.2.1. Vorversuch ………………………….. ………………………….. ………………………. 56 3.2.2. 1h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 61 3.2.3. 4h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 67 3.2.4. 24h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………… 73 4. Diskussion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 79 4.1. Auswertung der THP – 1 – Suspensionsz ellen ………………………….. …………….. 79 4.2. Auswertung der PMA – differenzierten THP – 1 – Zellen ………………………….. ….. 82 4.3. Fazit ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 83 Literaturverzeichnis ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 87 VI Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Struktureller Aufbau eines Mitochondriums (Boujard et al. 2014) ………. 4 Abbildung 2: Schematische Darstellung des Tricarbonsäure – Zyklus (Plattner und Hentschel 2011) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 5 Abbildung 3: Darstellung der oxidativen Phosphorylierung (Plattner und Hentschel 2011) ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 6 Abbildung 4: Modellverlauf der Oxygen Consumption Rate (OCR) über die Zeit (Agilent Technologies) ………………………….. ………………………….. ………………………….. 8 Abbildung 5: Magnetstreifen der Firma BIORELAX ………………………….. ……………… 21 Abbildung 6: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mitochondr iale Atmung in pmol O 2 /min 24 Abbildung 7: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale AT P – Produktion (dargestellt sind die fünf Einzelergebnisse in pmol O 2 /min) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 26 Abbildung 8: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mittelwert ( in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 26 Abbildung 9: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 27 Abbildung 10: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 28 Abbildung 11: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 29 Abbildung 12: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 31 Abbildung 13: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximal atmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 32 Abbildung 14: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 33 VII Abbildung 15: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (i n pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 33 Abbildung 16: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 35 Abbildung 17: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 37 Abbildung 18: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungs kapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 38 Abbildung 19: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserve atmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 39 Abbildung 20: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung f ür Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ….. 39 Abbildung 21: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 41 Abbildung 22: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondria le ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 43 Abbildung 23: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweich ung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 44 Abbildung 24: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 45 Abbildung 25: 8h S timulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ….. 45 Abbildung 26: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 47 Abbildung 27: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 49 VIII Abbildung 28: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maxi malatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 50 Abbildung 29: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 52 Abbildung 30: 24h Stimulation der THP – 1 – Zell en: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ….. 52 Abbildung 31: Entwicklung der mi tochondrialen Atmung der stimulierten THP – 1 – Zellen in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. …………………………. 54 Abbildung 32: Entwicklung der mitochondrialen Atmung der nic ht – stimulierten THP – 1 – Zellen in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. …………………………. 55 Abbildung 33: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 56 Abbildung 34: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungsk apazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. … 58 Abbildung 35: Vorversuch mit PMA – differe nzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 58 Abbildung 36: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 59 Abbildung 37: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 60 Abbildung 38: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 61 Abbildung 39: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produkt ion in pmol O 2 /min ………………………….. … 63 Abbildung 40: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweich ung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 64 IX Abbildung 41: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 65 Abbildung 42: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 66 Abbildung 43: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 67 Abbildung 44: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale A TP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. … 69 Abbildung 45: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 69 Abbildung 46: 4h Stimulation der PMA – dif ferenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 71 Abbildung 47: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Z ellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 71 Abbildung 48: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ……………………….. 73 Abbildung 49: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung u nd mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. … 75 Abbildung 50: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 75 Abbildung 51: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 77 Abbildung 52: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 77 X Tabellenverzeichnis Tabelle 1 : Stocklösungen ………………………….. ………………………….. ……………………. 16 Tabelle 2 : Arbeitslösungen ………………………….. ………………………….. ………………….. 16 Tabelle 3 : Befüllung Sensor ………………………….. ………………………….. …………………. 17 Tabelle 4: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 25 Tabelle 5: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapa zität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 27 Tabelle 6: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) 28 Tabelle 7: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 30 Tabelle 8: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 32 Tabelle 9: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 34 Tabelle 10: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 36 Tabell e 11: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 38 Tabelle 12: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 40 Tabelle 13: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenl eck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 42 Tabelle 14: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 44 Tabell e 15: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 46 XI Tabelle 16: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 48 Tabelle 17: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 51 Tabelle 18: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 53 Tabelle 19: Vorv ersuch mit PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 57 Tabelle 20: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 59 Tabelle 21: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 60 Tabelle 22: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitoc hondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 62 Tabelle 23: 1h Stimulation der PMA – differenziert en Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 64 Tabelle 24: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 66 Tabelle 25: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenl eck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 68 Tabelle 26: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 70 Tabelle 27: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 72 Tabelle 28: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – XII mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 74 Tabelle 29: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 76 Tabelle 30: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 78 XIII Abkürzungen ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat AO/PI Acridin Orange/Propidium Iodid BA Basalatmung BHI bioenergetic health index/Bioenergetischer Gesundheit sindex CO 2 Kohlenstoffdioxid CoA Coenzym A DNA Desoxyribonukleinsäure ECAR extracellular acidification rate/ extrazelluläre Ansäuerungsrate EDTA Ethylendiamintetraacetat FBS Fetal Bovine Serum FCCP Carbonyl cyanide – p – trifluoromethoxyphenylhydrazone Fe 2+ /Fe 3+ Eisen H Wasserstoff H 2 O Wasser KCl Kaliumchlorid KH 2 PO 4 Kaliumdihydrogenphosphat MA Maximalatmung mATP mitochondriale ATP – Produktion Na 2 HPO 4 Dinatriumhydrogenphosphat NaCl Natriumchlorid NAD + / NADH Nicotinamidadenindinukleotid nmA nicht – mitochondriale Atmung NTC Negativkontrolle O 2 Sauerstoff OCR oxygen consumption rate/Sauerstoffverbrauchsrate P i anorganische Phosphatgruppe XIV PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PDL Poly – D – lysine PL Protonenleck PMA Phorbol – 12 – myristat – 13 – acetat RAK Reserveatmungskapazität RPMI Roswell Park Memorial Institute RPMI – KM Komplettmedium RPMI – Mess Messmedium VE – H 2 O vollentsalzenes Wasser Verd. Verdünnung vgl. vergleiche XV Einheiten °C Grad Celsius µl Mikroliter µM Mikromolar cm 2 Quadratzentimeter g Gramm h Stunde l Liter M molar min Minute ml Milliliter mM Millimolar ng Nanogramm pmol Pikomol U Units 1 1. Einleitung „Die elektromagnetische Energie ist die elementare Energieform, von der jedes Leben eines Organismus a bhängt.“ Dieses Zitat wird Werner Heisenberg zugeschrieben, der 1932 den Physik – Nobelpreis für seine Arbeit im Bereich der Quantenmechanik erhielt. Neben den klassischen Methoden in der sogenannten „Schulmedizin“ werden heutzutage im Bereich der „alternativen Medizin“ Verfahren ang ewandt, die schon seit Jahrhunderten Verwendung finden und auf möglichst natürliche Art und Weise Hilfe bei Erkrankungen und körperlichen Beschwerden versprechen. Einen Schwerpunkt stellen Behandlungen und Therapien dar, die auf elektromagnetische Kräfte z urückgreifen. Die Idee der Nutzung künstlich erzeugter Magnetfelder als Anwendungen bei Patienten beruht auf der Grundlage des ständigen Magnetfeldes der Erde und der elektrochemischen Vorgänge im Menschen. Treten beispielsweise schwere Erkrankungen auf, s o stehen diese im Zusammenhang mit einer Störung der normalen Funktionalität von Zellen . Der Einsatz schwacher Magnetfelder zielt darauf ab, die Rückkehr betroffener Zellen in ihren Normalzustand zu fördern und somit eine Verbesserung des Gesundheitszustan des des Patienten zu erreichen. Alle Zellen des menschlichen Körpers betreiben Stoffwechselreaktionen (Metabolismus), die der Erhaltung oder dem Aufbau von Zellmaterial dienen (Anabolismus) oder die körpereigene und körperfremde Stoffe abbauen (Katabolismus). Während anabolische Vorgänge unter Energieverbrauch stattfinden wird durch katabolische Prozesse unter anderem Energie gewonnen. Für alle metabolischen Abläufe werden Enzyme benötigt. Diese binden spezifisch Moleküle und wirken als Katalysa toren, indem sie die Aktivierungsenergie chemischer Reaktionen herabsetzen und somit Stoffumwandlungen beschleunigen. Dabei verbrauchen Enzyme Energie, die die Zellen bereitstellen müssen. Hauptenergieträger ist das Adenosintriphosphat (ATP), bei dem durch die Abspaltung einer anorganischen Phosphat – Gruppe ( P i ) Energie freigesetzt wird. Während der Umwandlung von Substraten ändern Enzyme ihre Konformation. Diese Änderung stellt Arbeit für das Enzym dar und bedarf daher Energie. Wird ATP zu 2 Adenosindiphospha t (ADP) und P i hydrolysiert, können Enzyme den anorganischen Phosphat – Rest binden und werden dadurch energetisiert (Protein – Phosphorylierung). Die Bereitstellung der Energie in Form von ATP wird durch die Mitochondrien einer Zelle übernommen. In ihnen fin det die oxidative Phosphorylierung statt, die aus den Stoffwechselprodukten der Glykolyse oder alternativ aus der Verbrennung von Fettsäuren über mehrere Schritte ATP generiert. Da Zellen ohne Energie nicht arbeiten und überleben können , kommt den Mitochon drien eine grundlegende Rolle bei der Integrität von Zellen zu. Eine Fehlfunktion der Mitochondrien führt zu Mitochondriopathien, die gerade in Körperbereichen mit hoher Energieanforderung wie der Muskulatur oder dem Nervensystem zu großen Schäden führen k önnen (Hofmann und Bauer 2005) . Einige neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer (Lee et al. 2017) und Morbus Parkinson (Franco – Iborra et al. 2016) sowie Diabetes (Chen et al. 2012) , Krebs (Zong et al. 2016) und Herz – Kreislauferkrankungen (Lemieux und Hoppel 2009) stehen im Zusammenhang mit einer Schädigung der Mitochondrien. Diese kann aufgrund einer fehlerhaften Replikation der Mitochondrien auftreten oder durch Störungen in den Stoffwechselwegen der ATP – Produktion verursac ht werden. Ausgehend von der Annahme, dass vereinzelte magnetischer Felder einen positiven Effekt auf Patienten haben können, indem sie z.B. auf in ihrer Funktionalität eingeschränkte Zellen wirken, stellt sich zunächst die Frage, inwieweit solche Magnetf elder gesunde Zellen beeinflussen. Bernhard Klein vom Institut für Naturheilverfahren und physikalische Anwendungen in Bremen hat schwache permanente inhomogene Magnetfelder entwickelt, die zum Beispiel in Form einer Matratzenauflage über mehrere Stunden k ontinuierlich auf einen Patienten einwirken können. Die nach ihrem Erfinder benannten Kleinschen Felder gehen dabei Wechselwirkungen mit einzelnen Strukturen im Körper ein und zielen unter anderem auf eine bessere Nährstoffversorgung von Zellen ab. Zur Un tersuchung des Einflusses permanenter Magnetfelder auf gesunde Zellen bedarf es messbarer zellulärer Parameter, die Auskunft über den allgemeinen Zustand der Zellen geben können. Unabhängig vom Zelltyp lassen sich Aussagen über die Aktivität einer Zelle an hand ihres metabolischen Potentials treffen. Als 3 Energieträger der meisten Vorgänge in menschlichen Zellen fungiert das in den Mitochondrien gebildete ATP. Eine Betrachtung des Bioenergetischen Gesundheitsindex‘ (BHI) kann Informationen über energetische V orgänge in Mitochondrien liefern und eine Beurteilung der Leistungsfähigkeit von Zellen ermöglichen. 1.1. Kleinsche Felder Kleinsche Felder sind schwache permanente polymorphe Magnetfelder, die im Gegensatz zu sonst häufig eingesetzten pulsierenden Magnetfe ldern ohne Strom arbeiten. Pulsierende Magnetfelder erzeugen schwache oszillierende magnetische Impulse, die Zellen im Körper anregen sollen, indem Energie durch die Impulse auf die Zellen übertragen wird. Kleinsche Felder generieren ebenfalls ein schwache s Magnetfeld, das jedoch nicht pulsiert, sondern permanent vorhanden ist. Zurückzuführen ist dies auf Positiv – und Negativpole mit einer Größe von wenigen Millimetern, die schachbrettartig angeordnet sind. Durch die ständig w e chselnde Polung der Magnete wi rd ein schwaches Magnetfeld erzeugt, das inhomogen bzw. polymorph ist. Dieses Feld kann aufgrund seiner Statik keine Wechselwirkungen mit stationären Strukturen eingehen. Nur bewegliche Strukturen im Körper wie Blut oder Lymphe, die sich über ein solches p ermanentes polymorphes Magnetfeld bewegen, erfahren einen elektromagnetischen Einfluss. 1.2. Mitochondrien Da jede Zelle im Zuge ihrer spezifischen Stoffwechselreaktionen ATP verbraucht, muss dieses kontinuierlich in den Mitochondrien aufgebaut werden. Jede Zelle ist energetisch autonom und produziert die Menge an Energie, die sie benötigt. In allen Mitochondri en laufen die gleichen Prozesse ab, jedoch kann die Anzahl an Mitochondrien abhängig vom Zelltyp und somit die Menge an bereitgestellter Energie 4 variieren. Der strukturelle Aufbau eines Mitochondriums ist in Abbildung 1 dargestellt. Mitochondrien besitzen ebenso wie der Zellkern eine Doppelmembran. Zwischen der Außen – und der Innenmembran befindet sich ein Intermembranraum, der auch als perimitochondrialer Spalt bezeichnet wird. Ionen und kleine Moleküle können durch die äußere Membran diffundieren, wohinge gen ein Transport durch die Innenmembran nur über spezifische Proteine (Carrier) möglich ist. Sauerstoff (O 2 ) und Kohlenstoffdioxid (CO 2 ) können beide Membranen ungehindert passieren. Das für die Prozesse der Energiegewinnung benötigte Pyruvat wird aus dem Cytosol mittels eines Pyruvat – Shuttles durch die innere Mitochondrienmembran geschleust. Der Austausch von ADP und ATP durch die Innenmembran erfolgt über einen Antiporter. Der Innenraum des Mitochondriums (Mitochondrien – Matrix) wird durch die innere Memb ran umschlossen, die mehrere Einstülpungen (Cristae) in die Matrix besitzt. Die Membran der Cristae wird von ATP – Synthasen und weiteren Membranproteinen durchspannt, die an der Synthese des ATP beteiligt sind. Abbildung 1 : Struktureller Aufbau eines Mitochondriums (Boujard et al. 2014) Die Energiegewinnung in Mitochondrien besteht aus mehreren hintereinandergeschalteten Prozessen (s. Abbildung 2 ). Im M atrixraum wird das aus der im Cytosol bei der Glykolyse gebildete Pyruvat (Brenztraubensäure) weiterverarbeitet, bevor es in den Tricarbonsäure – Zyklus (Citrat – Zyklus) einfließt. Unter der Abspaltung von CO 2 (Decarboxylierung) und Wasserstoff (H; Oxidation) entsteht aus dem Pyruvat Acetat (Essigsäure), das mit Coenzym A (CoA) den Acetyl – CoA – Komplex bildet. Der freigewordene Wasserstoff würde mit dem in der Matrix 5 gelösten Sauerstoff in einer Knallgas – Reaktion verpuffen und die Zelle zerstören, weswegen die H – Atome an vorhandenes NAD + binden und dieses zu NADH reduzieren. Acetyl – CoA tritt nun in den Citrat – Zyklus ein, indem es eine Bindung mit dem vier Kohlenstoffatome enthaltenen Oxalacetat eingeht, bei der erneut eine Reduktion von NAD + stattfindet. Es entst eht Citrat (Zitronensäure), das sechs Kohlenstoffatome besitzt. Citrat wird decarboxyliert und NAD + anschließend reduziert. Die dabei entstandene α – Ketoglutarsäure wird durch wiederholte Reduktion von NAD + und Decarboxylierung zu Succinat (Bernsteinsäure), aus dem über weitere Zwischenstufen wieder Oxalacetat gebildet wird. Das anfallende CO 2 wird aus den Mitochondrien exportiert. Somit gehen aus der Umwandlung eines Pyruvat – Moleküls vier NADH – Moleküle hervor, die den nächsten Schritt bei der Energiegewinnu ng einleiten. Abbildung 2 : Schematische Darstellung des Tricarbonsäure – Zyklus (Plattner und Hentschel 2011) In der Cristae – Membran kommt es nun zur oxidativen Phosphorylierung, die auch Zellatmung genannt wird. Dargestellt ist dies in Abbildung 3 . Gek oppelt an die 6 Verwertung von O 2 wird ATP generiert. Die NADH – Dehydrogenase stellt das Ziel der in der Matrix befindlichen NADH – Moleküle dar. Sie oxidiert ein Molekül NADH zu NAD + , einem Proton (H + ) und einem Elektron (e – ). Das Elektron wird von einem Cytoc hrom aufgenommen und in einer Kette von Cytochromen weitergegeben (Atmungskette). Cytochrome besitzen in ihrer Häm – Gruppe ein Eisenatom, das bei Eintritt eines Elektrons seine Wertigkeit von Fe 3+ zu Fe 2+ ändert und bei Abgabe eines Elektrons wieder zu Fe 3+ . Der Elektronentransport durch die Atmungskette mündet in der Cytochromoxidase. Sie entlässt die Elektronen wieder in die Matrix und verknüpft diese zusammen mit Protonen und Sauerstoff zu Wasser (H 2 O). Der entscheidende Mechanismus der Atmungskette beste ht im indirekten Transport von Protonen in den perimitochondrialen Spalt, da diese den Elektronen hinterherdiffundieren. Hierbei handelt es sich um eine chemo – osmotische Kopplung, bei der aus der Verarbeitung organischer Substrate osmotische Energie in For m eines Protonengradienten hervorgeht. Die Protonen sammeln sich im Intermembranraum an, da sie weder die Innenmembran in Richtung Matrix passieren können, noch durch die Cytochromoxidase gelangen. Der entstandene H + – Gradient kann nur über den Transport de r Protonen in die Matrix durch die ATP – Synthasen aufgelöst werden. Dieser Vorgang stellt eine osmo – chemische Kopplung dar, da die Aufhebung des Gradienten eine Substrat – Synthese bewirkt. Die ATP – Synthasen funktionieren wie eine Turbine, bei der die Protone n eine Art Rotor antreiben, der sich auf der Matrix – Seite befindet. Durch reversible Konformationsänderungen wandelt sich die Bewegungsenergie in chemische Energie um, die ATP aus ADP und P i synthetisiert (Plattner und Hentschel 2011; Boujard et al. 2014) . Abbildung 3 : Darstellung der oxidativen Phosphorylierung (Plattner und Hentschel 2011) 7 1.3. Bioenergetischer Gesundheitsindex Der Bioen ergetische Gesundheitsindex ( Bioenergetic Health Index – BHI ) gibt Auskunft über den Gesundheitszustand von Mitochondrien. Diese Beurteilung der mitochondrialen Bioenergetik kann als eine Art Frühwarnsystem des Körpers eingesetzt werden, da viele Erkrankun gen mit Dysfunktionen der Mitochondrien einhergehen und inflammatorische Prozesse in Zellen des Immunsystems einen erhöhten Energiebedarf besitzen. Der BHI stellt somit einen Biomarker dar, der Erkenntnisse über mögliche Beschwerden oder Krankheiten dadurc h liefern kann, dass das metabolische Potential der Zellen über ihre Mitochondrien bestimmt wird (König 2016) . Der Test der Mitochondrien erfolgt mith ilfe chemischer Modulatoren, die Einfluss auf die Atmungskette nehmen. Gemessen wird die mitochondriale Atmung über die Sauerstoffverbrauchsrate ( Oxygen Consumption Rate – OCR ) während der aufeinanderfolgenden Zugabe dreier Substanzen zu den untersuchten Z ellen. Zunächst gelangt Oligomycin in den perimitochondrialen Spalt und inhibiert dort die ATP – Synthase. Der angestaute Protonen – Gradient kann sich nicht auflösen und führt dazu, dass keine weiteren Elektronen durch die Cytochromkette transportiert werden. Die Cytochromoxidase arbeitet nicht und verbraucht keinen Sauerstoff; der OCR fällt ab. Anschließend erhalten die Zellen den Entkoppler FCCP (Carbonyl cyanide – p – trifluoromethoxyphenylhydrazone), der in Lage ist, Protonen durch die mitochondriale Innenmemb ran zu schleusen. Die Protonen im Intermembranraum fließen in die Matrix und die Elektronentransportkette der Cytochrome wird wieder in Gang gesetzt. Die Cytochromoxidase läuft auf voller Kapazität, was zu einer Steigerung des OCR führt. Zuletzt werden die Zellen einer Mischung aus Rotenone und Antimycin A ausgesetzt. Rotenone inhibiert die NADH – Dehydrogenase und Antimycin A fungiert als Inhibitor des Komplex III der Cytochromkette. Die Zellatmung wird gestoppt und der OCR sinkt wieder. 8 Abbildung 4 : Modellverlauf der Oxygen Consumption Rate (OCR) über die Zeit (Agilent Technologies) Wie i n Abbildung 4 zu sehen ist , ergibt sich ein Modellverlauf des OCR über die Zeit mit den markierten Punkten der Zugabe der Modulatoren. Anfangs wird ein Normalzustand der Zellen gemessen, den die Basalatmung ( Basal Respiration ) widerspiegelt. Sie gibt Auskunft über den Energiebedarf der Mitochondrien, der unter normalen Bedingungen gedeckt wird. Die zelleigene ATP – Produktion ( ATP Production ) kann als Differenz des OCR vor und nach der Inhibierung durch Oligomycin bestimmt werden. ATP – Produktion und Protonenleck ( Proton Leak ) ergeben z usammen die Basalatmung. Das Protonenleck steht hierbei für die Menge verbrauchter Elektronen, die ohne Produktion von ATP durch die Cytochromoxidase mit Sauerstoff umgesetzt werden. Der Anstieg des OCR über die Basalatmung hinaus nach Zugabe von FCCP führ t zur Maximalatmung ( Maximal Respiration ), die das maximal mögliche Potential der mitochondrialen Atmung darstellt. Die Differenz zwischen Maximalatmung und ATP – Produktion bildet die Reserveatmungskapazität ( Spare Capacity ). Sie beschreibt die Fähigkeit de r Mitochondrien, bei zusätzlicher Energieanforderung Energie bereitzustellen. Alle Prozesse der Zelle, die Sauerstoff nicht im Zuge der Energieproduktion verbrauchen werden als nicht – mitochondriale Atmung ( Non – mitochondrial Oxygen Consumption ) bezeichnet. Sie lässt sich durch den OCR nach Beendigung der Zellatmung bestimmen (Agilent Technol ogies) . 9 Der BHI kann nun mit folgender Formel berechnet werden (Chacko et al. 2014) : 퐵퐻퐼 = log 푅푒푠푒푟푣푒푎푡푚푢푛푔푠푘푎푝푎푧푖푡 ä 푡 푥 퐴푇푃 − 푃푟표푑푢푘푡푖표푛 푛푖푐 ℎ 푡 − 푚푖푡표푐 ℎ 표푛푑푟푖푎푙푒 퐴푡푚푢푛푔 푥 푃푟표푡표푛푒푛푙푒푐푘 (1) Ein niedriger BHI deutet auf eine mögliche Fehlfunktion der Mitochondrien hin, die sich durch eine geringe ATP – Produktion und Reserveatmungskapazität, sowie ein erhöhtes Protonenleck äußert. Im Gegensatz dazu steht ein hoher BHI für gesunde Mitochondrien mit einem guten metabolischen Potential. 10 2. Material und Me thoden 2.1. Materialien Hersteller Artikelnummer Pipetten peqPETTE 1000E (100 – 1000 µl) peqlab Biotechnologie GmbH 103820032 peqPETTE 200E (20 – 200 µl) peqlab Biotechnologie GmbH 162330020 peqPETTE 10E (0,5 – 10 µl) peqlab Biotechnologie GmbH 48379 peqMATE peqlab Biotechnologie GmbH 103820032 SEROLOGICAL PIPETTE 5 ml und 10 ml SARSTEDT 861253001 861254001 Pipettenspitzen Top – Line 100 – 1000 µl AH N Biotechnologie GmbH 1 – 201 – 50 – 0 Top – Line 1 – 200 µl AH N Biotechnologie GmbH 1 – 111 – 60 – 0 Top – Line 0,5 – 10 µl SARSTEDT 70.1115 Reaktionsgefäße/Zellkulturröhrchen Reaktionsgefäße 1,5 ml Eppendorf AG 0030120086 Reaktionstubes 50 ml (steril) SARSTEDT 62.547.254 Reaktionstubes 15 ml (steril) SARSTEDT 62.544.502 11 Zellkulturflaschen CELLSTAR Zellkulturflasche, 50ml, 25cm 2 , Filterschraubverschluss (T25 – Flasche, rote Kappe) Greiner Bio – One 690175 CELLSTAR Suspensionskulturflasche, 50ml, Filterschraubverschluss (T25 – Flasche, weiße Kappe) Greiner Bio – One 690195 CELLSTAR Zellkulturflasche, 250ml, 75cm 2 , Filterschraubverschluss (T75 – Flasche, rote Kappe) Greiner Bio – One 658175 CELLSTAR Suspensionskulturflasche, 250ml, Filterschraubverschluss (T75 – Flasche, weiße Kappe) Greiner Bio – One 658195 Zählkammer Cellometer Counting Chambers Nexcelom Bioscience/peqlab Biotechnologie GmbH 91 – CMCCP – 01 Seahorse XFp Assay Cartridge Seahorse Bioscience 103022 – 100 XFp Cell Culture Miniplate Seahorse Bioscience 103025 – 100 XFp Cell Mito Stress Test Kit Seahorse Bioscience 103010 – 100
