Studien > Jonas Heisterkamp – Beeinflussung der mitochondrialen Bioenergetik durch permanente polymorphe Magnetfelder – Klein’sche Felder I Otto – von – Guericke – Universität Magdeburg Bachelorarbeit Beeinflussung der mitochondrialen Bioenergetik durch permanente polymorphe Magnetfelder Jonas Heisterkamp Betreuer: Prof. Dr. Brigitte König Prof. Dr. Gerhard Jorch I Zusammenfassung In der Medizin werden seit langem Magnetfelder verschiedener Art zur Therapie unterschiedlicher Erkrankungen eingesetzt. Einen neuen Typen stellen hierbei permanente polymorphe Magnetfelder dar, die ohne Strom arbeiten. Aufgrund einer mosaikartigen abwechselnden Anordnung von Positiv – und Negativpolen entsteht ein inhomogenes Magnetfeld, das in der L age ist, mit beweglichen Strukturen innerhalb eines Organismus in Wechselwirkung zu treten. Beim Menschen sind dies vorrangig Körperflüssigkeiten wie etwa Blut oder Lymphe. Diese erfahren beim Vorbeifließen an der komplexen Polanordnung einen elektromagnet ischen Einfluss. Die Mitochondrien als „Kraftwerke der Zelle“ sind die Orte der Energieproduktion in menschlichen Zellen. Gerade in Immunzellen spielen Mitochondrien eine grundlegende Rolle bei zellulärer Aktivität, Proliferation und Differenzierung. Sch on seit einiger Zeit wird vermutet, dass eine Fehlfunktion der Mitochondrien und eine damit einhergehende Störung der ATP – Produktion sowohl Grundlage als auch Ergebnis vieler Erkrankungen sind . Zur Beurteilung des Gesundheitsstatus‘ von Mitochondrien wird bei medizinischen Untersuchungen der Bioenergetische Gesundheitsindex (BHI) herangezogen. Über verschiedene Größen der mitochondrialen Atmung kann so eine Aussage zum metabolische n Potent ial einer Zelle getroffen werden. In der vorliegenden Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob polymorphe permanente Magnetfelder in Form der Kleinschen Felder einen Einfluss auf die Bioenergetik von Mitochondrien ausüben. Als Zielzellen wurden dafür THP – 1 – Zellen sowohl als Suspensi ons – , als auch als PMA – differenzierte Zellen verwendet. Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche der Stimulation von menschlichen Immunzellen mit permanenten polymorphen Magnetfeldern zeigen, dass es einen Effekt der Kleinschen Felder auf die Mitochond rien gibt, der sich in der mitochondrialen Atmung widerspiegelt. Vielfach auftretende höhere Werte bei den stimulierten Zellen im Vergleich zu nicht – stimulierten Zellen gehen dabei auf eine gesteigerte Aktivität der Mitochondrien zurück. Die Ergebnisse las sen den Schluss zu, dass polymorphe permanente Magnetfelder einen Beitrag zur Steigerung des metabolischen Potentials von menschlichen Immunzellen leisten können. II Abstract The medicine has used magnetic fields of various types for a long time to treat dif ferent diseases. New types are persistent polymorphous magnetic fields without using power . Due to a mosaic – like alternating structure of positiv e and negativ e poles an inhomogeneous magnetic field is generated that is able to interact with motile structur es of an organism. In humans these structures are primarily body fluids like blood or lymph. When they flow past the sophisticated arrangement they get an electromagnetic influence. The mitochondrion as the ‘powerhouse of the cell’ is the place of energy production in human cells. Especially in immune cells the mitochondria are a basic part of cellular activity, proliferation and differentiation. For some while it is suspected that a dysfunction of mitochondria and a disorder of ATP production, which comes along with, are both basis and result of many diseases. In order to evaluate the health condition of mitochondria the Bioenergetic Health Index (BHI) is used as an indicator of cellular and mitochondrial health . Declarations about the metabolic potential of a cell can be made by different factors of mitochondrial respiration. In the present thesis it should be examined if polymorphous persistent magnetic fields in the form of Kleinsche Felder have an influence on the bioenergetics of mitochondria. THP – 1 – s uspension and PMA – differentiated THP – 1 – cells were used as target cells. The attempts performed in this thesis of stimulating human immune cells with persistent polymorphous magnetic fields show an effect of the Kleinsche Felder on the mitochondria, which c an be watched in the mitochondrial respiration. Multiply occurring high values of stimulated cells compared to non – stimulated cells trace back to an enhanced activity of mitochondria. These results lead to the conclusion that polymorphous persistent magnet ic fields can contribute to the increase of metabolic potential of human immune cells. III Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmitt el angefertigt habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Bachelorarbeit stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form als Bachelorarbeit eingereicht und ist als Ganzes auch noch nicht veröffentlicht. _______________________ Magdeburg, 2 9 .11. 2017 IV Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… I Abstract ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. II Eidesstattliche Erklärung ………………………….. ………………………….. ……………………… III Inhaltsverzeichnis ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… IV Abbildungsverzeichnis ………………………….. ………………………….. …………………………. VI Tabellenverzeichnis ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. X Abkürzungen ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. XIII Einheiten ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. XV 1. Einleitung ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 1 1.1. Kleinsche Felder ………………………….. ………………………….. ………………………. 3 1.2. Mitochondrien ………………………….. ………………………….. ………………………….. 3 1.3. Bioenergetischer Gesundheitsindex ………………………….. ………………………… 7 2. Material und Methoden ………………………….. ………………………….. …………………. 10 2.1. Materialien ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 10 2.2. Reagenzien und Medien ………………………….. ………………………….. ………….. 12 2.3. Geräte ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 13 2.3.1. Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience) ………………………….. ………… 14 2.3.2. Seahorse XFp Analyzer (Agilent Technologies) ………………………….. …. 15 2.4. Vorbereitungen für Untersuchungen von Zellen im Seahorse ………………… 15 2.5. Anzucht von Zellen aus der Kryokultur ………………………….. …………………… 18 2.6. Kultivierung un d Pflege der Zellen ………………………….. …………………………. 19 2.7. Stimulation der Zellen mit Magnetstreifen ………………………….. ………………. 20 2.8. Aufarbeitung der Zellen für Untersuchungen im Seahorse …………………….. 22 3. Ergebnisse ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 24 3.1. THP – 1 – Zellen ………………………….. ………………………….. …………………………. 24 V 3.1.1. Vorversuch ………………………….. ………………………….. ………………………. 24 3.1.2. 1h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 29 3.1.3. 4h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 35 3 .1.4. 8h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 41 3.1.5. 24h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………… 47 3.1.6. Kinetik der mitochondrialen Atmung ………………………….. ………………… 54 3.2. PMA – differenzierte Zellen ………………………….. ………………………….. ………… 56 3.2.1. Vorversuch ………………………….. ………………………….. ………………………. 56 3.2.2. 1h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 61 3.2.3. 4h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………….. 67 3.2.4. 24h Stimulation ………………………….. ………………………….. ………………… 73 4. Diskussion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 79 4.1. Auswertung der THP – 1 – Suspensionsz ellen ………………………….. …………….. 79 4.2. Auswertung der PMA – differenzierten THP – 1 – Zellen ………………………….. ….. 82 4.3. Fazit ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 83 Literaturverzeichnis ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 87 VI Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Struktureller Aufbau eines Mitochondriums (Boujard et al. 2014) ………. 4 Abbildung 2: Schematische Darstellung des Tricarbonsäure – Zyklus (Plattner und Hentschel 2011) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 5 Abbildung 3: Darstellung der oxidativen Phosphorylierung (Plattner und Hentschel 2011) ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 6 Abbildung 4: Modellverlauf der Oxygen Consumption Rate (OCR) über die Zeit (Agilent Technologies) ………………………….. ………………………….. ………………………….. 8 Abbildung 5: Magnetstreifen der Firma BIORELAX ………………………….. ……………… 21 Abbildung 6: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mitochondr iale Atmung in pmol O 2 /min 24 Abbildung 7: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale AT P – Produktion (dargestellt sind die fünf Einzelergebnisse in pmol O 2 /min) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 26 Abbildung 8: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mittelwert ( in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 26 Abbildung 9: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 27 Abbildung 10: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 28 Abbildung 11: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 29 Abbildung 12: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 31 Abbildung 13: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximal atmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 32 Abbildung 14: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 33 VII Abbildung 15: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (i n pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 33 Abbildung 16: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 35 Abbildung 17: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 37 Abbildung 18: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungs kapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 38 Abbildung 19: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserve atmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 39 Abbildung 20: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung f ür Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ….. 39 Abbildung 21: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 41 Abbildung 22: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondria le ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 43 Abbildung 23: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweich ung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 44 Abbildung 24: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 45 Abbildung 25: 8h S timulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ….. 45 Abbildung 26: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 47 Abbildung 27: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. …………………… 49 VIII Abbildung 28: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maxi malatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 50 Abbildung 29: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 52 Abbildung 30: 24h Stimulation der THP – 1 – Zell en: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ….. 52 Abbildung 31: Entwicklung der mi tochondrialen Atmung der stimulierten THP – 1 – Zellen in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. …………………………. 54 Abbildung 32: Entwicklung der mitochondrialen Atmung der nic ht – stimulierten THP – 1 – Zellen in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. …………………………. 55 Abbildung 33: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 56 Abbildung 34: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungsk apazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. … 58 Abbildung 35: Vorversuch mit PMA – differe nzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 58 Abbildung 36: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 59 Abbildung 37: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 60 Abbildung 38: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 61 Abbildung 39: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produkt ion in pmol O 2 /min ………………………….. … 63 Abbildung 40: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweich ung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 64 IX Abbildung 41: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 65 Abbildung 42: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 66 Abbildung 43: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 67 Abbildung 44: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale A TP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. … 69 Abbildung 45: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 69 Abbildung 46: 4h Stimulation der PMA – dif ferenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 71 Abbildung 47: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Z ellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 71 Abbildung 48: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ……………………….. 73 Abbildung 49: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung u nd mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min ………………………….. … 75 Abbildung 50: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 75 Abbildung 51: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 77 Abbildung 52: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % … 77 X Tabellenverzeichnis Tabelle 1 : Stocklösungen ………………………….. ………………………….. ……………………. 16 Tabelle 2 : Arbeitslösungen ………………………….. ………………………….. ………………….. 16 Tabelle 3 : Befüllung Sensor ………………………….. ………………………….. …………………. 17 Tabelle 4: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 25 Tabelle 5: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapa zität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 27 Tabelle 6: Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) 28 Tabelle 7: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 30 Tabelle 8: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 32 Tabelle 9: 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 34 Tabelle 10: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 36 Tabell e 11: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 38 Tabelle 12: 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 40 Tabelle 13: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenl eck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 42 Tabelle 14: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 44 Tabell e 15: 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 46 XI Tabelle 16: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ……….. 48 Tabelle 17: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………………. 51 Tabelle 18: 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 53 Tabelle 19: Vorv ersuch mit PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 57 Tabelle 20: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 59 Tabelle 21: Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 60 Tabelle 22: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitoc hondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 62 Tabelle 23: 1h Stimulation der PMA – differenziert en Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 64 Tabelle 24: 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 66 Tabelle 25: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenl eck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 68 Tabelle 26: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………………………….. ………………… 70 Tabelle 27: 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 72 Tabelle 28: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – XII mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 74 Tabelle 29: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % ………………………….. ………. 76 Tabelle 30: 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) ………………………….. ………………………….. ………………………. 78 XIII Abkürzungen ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat AO/PI Acridin Orange/Propidium Iodid BA Basalatmung BHI bioenergetic health index/Bioenergetischer Gesundheit sindex CO 2 Kohlenstoffdioxid CoA Coenzym A DNA Desoxyribonukleinsäure ECAR extracellular acidification rate/ extrazelluläre Ansäuerungsrate EDTA Ethylendiamintetraacetat FBS Fetal Bovine Serum FCCP Carbonyl cyanide – p – trifluoromethoxyphenylhydrazone Fe 2+ /Fe 3+ Eisen H Wasserstoff H 2 O Wasser KCl Kaliumchlorid KH 2 PO 4 Kaliumdihydrogenphosphat MA Maximalatmung mATP mitochondriale ATP – Produktion Na 2 HPO 4 Dinatriumhydrogenphosphat NaCl Natriumchlorid NAD + / NADH Nicotinamidadenindinukleotid nmA nicht – mitochondriale Atmung NTC Negativkontrolle O 2 Sauerstoff OCR oxygen consumption rate/Sauerstoffverbrauchsrate P i anorganische Phosphatgruppe XIV PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PDL Poly – D – lysine PL Protonenleck PMA Phorbol – 12 – myristat – 13 – acetat RAK Reserveatmungskapazität RPMI Roswell Park Memorial Institute RPMI – KM Komplettmedium RPMI – Mess Messmedium VE – H 2 O vollentsalzenes Wasser Verd. Verdünnung vgl. vergleiche XV Einheiten °C Grad Celsius µl Mikroliter µM Mikromolar cm 2 Quadratzentimeter g Gramm h Stunde l Liter M molar min Minute ml Milliliter mM Millimolar ng Nanogramm pmol Pikomol U Units 1 1. Einleitung „Die elektromagnetische Energie ist die elementare Energieform, von der jedes Leben eines Organismus a bhängt.“ Dieses Zitat wird Werner Heisenberg zugeschrieben, der 1932 den Physik – Nobelpreis für seine Arbeit im Bereich der Quantenmechanik erhielt. Neben den klassischen Methoden in der sogenannten „Schulmedizin“ werden heutzutage im Bereich der „alternativen Medizin“ Verfahren ang ewandt, die schon seit Jahrhunderten Verwendung finden und auf möglichst natürliche Art und Weise Hilfe bei Erkrankungen und körperlichen Beschwerden versprechen. Einen Schwerpunkt stellen Behandlungen und Therapien dar, die auf elektromagnetische Kräfte z urückgreifen. Die Idee der Nutzung künstlich erzeugter Magnetfelder als Anwendungen bei Patienten beruht auf der Grundlage des ständigen Magnetfeldes der Erde und der elektrochemischen Vorgänge im Menschen. Treten beispielsweise schwere Erkrankungen auf, s o stehen diese im Zusammenhang mit einer Störung der normalen Funktionalität von Zellen . Der Einsatz schwacher Magnetfelder zielt darauf ab, die Rückkehr betroffener Zellen in ihren Normalzustand zu fördern und somit eine Verbesserung des Gesundheitszustan des des Patienten zu erreichen. Alle Zellen des menschlichen Körpers betreiben Stoffwechselreaktionen (Metabolismus), die der Erhaltung oder dem Aufbau von Zellmaterial dienen (Anabolismus) oder die körpereigene und körperfremde Stoffe abbauen (Katabolismus). Während anabolische Vorgänge unter Energieverbrauch stattfinden wird durch katabolische Prozesse unter anderem Energie gewonnen. Für alle metabolischen Abläufe werden Enzyme benötigt. Diese binden spezifisch Moleküle und wirken als Katalysa toren, indem sie die Aktivierungsenergie chemischer Reaktionen herabsetzen und somit Stoffumwandlungen beschleunigen. Dabei verbrauchen Enzyme Energie, die die Zellen bereitstellen müssen. Hauptenergieträger ist das Adenosintriphosphat (ATP), bei dem durch die Abspaltung einer anorganischen Phosphat – Gruppe ( P i ) Energie freigesetzt wird. Während der Umwandlung von Substraten ändern Enzyme ihre Konformation. Diese Änderung stellt Arbeit für das Enzym dar und bedarf daher Energie. Wird ATP zu 2 Adenosindiphospha t (ADP) und P i hydrolysiert, können Enzyme den anorganischen Phosphat – Rest binden und werden dadurch energetisiert (Protein – Phosphorylierung). Die Bereitstellung der Energie in Form von ATP wird durch die Mitochondrien einer Zelle übernommen. In ihnen fin det die oxidative Phosphorylierung statt, die aus den Stoffwechselprodukten der Glykolyse oder alternativ aus der Verbrennung von Fettsäuren über mehrere Schritte ATP generiert. Da Zellen ohne Energie nicht arbeiten und überleben können , kommt den Mitochon drien eine grundlegende Rolle bei der Integrität von Zellen zu. Eine Fehlfunktion der Mitochondrien führt zu Mitochondriopathien, die gerade in Körperbereichen mit hoher Energieanforderung wie der Muskulatur oder dem Nervensystem zu großen Schäden führen k önnen (Hofmann und Bauer 2005) . Einige neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer (Lee et al. 2017) und Morbus Parkinson (Franco – Iborra et al. 2016) sowie Diabetes (Chen et al. 2012) , Krebs (Zong et al. 2016) und Herz – Kreislauferkrankungen (Lemieux und Hoppel 2009) stehen im Zusammenhang mit einer Schädigung der Mitochondrien. Diese kann aufgrund einer fehlerhaften Replikation der Mitochondrien auftreten oder durch Störungen in den Stoffwechselwegen der ATP – Produktion verursac ht werden. Ausgehend von der Annahme, dass vereinzelte magnetischer Felder einen positiven Effekt auf Patienten haben können, indem sie z.B. auf in ihrer Funktionalität eingeschränkte Zellen wirken, stellt sich zunächst die Frage, inwieweit solche Magnetf elder gesunde Zellen beeinflussen. Bernhard Klein vom Institut für Naturheilverfahren und physikalische Anwendungen in Bremen hat schwache permanente inhomogene Magnetfelder entwickelt, die zum Beispiel in Form einer Matratzenauflage über mehrere Stunden k ontinuierlich auf einen Patienten einwirken können. Die nach ihrem Erfinder benannten Kleinschen Felder gehen dabei Wechselwirkungen mit einzelnen Strukturen im Körper ein und zielen unter anderem auf eine bessere Nährstoffversorgung von Zellen ab. Zur Un tersuchung des Einflusses permanenter Magnetfelder auf gesunde Zellen bedarf es messbarer zellulärer Parameter, die Auskunft über den allgemeinen Zustand der Zellen geben können. Unabhängig vom Zelltyp lassen sich Aussagen über die Aktivität einer Zelle an hand ihres metabolischen Potentials treffen. Als 3 Energieträger der meisten Vorgänge in menschlichen Zellen fungiert das in den Mitochondrien gebildete ATP. Eine Betrachtung des Bioenergetischen Gesundheitsindex‘ (BHI) kann Informationen über energetische V orgänge in Mitochondrien liefern und eine Beurteilung der Leistungsfähigkeit von Zellen ermöglichen. 1.1. Kleinsche Felder Kleinsche Felder sind schwache permanente polymorphe Magnetfelder, die im Gegensatz zu sonst häufig eingesetzten pulsierenden Magnetfe ldern ohne Strom arbeiten. Pulsierende Magnetfelder erzeugen schwache oszillierende magnetische Impulse, die Zellen im Körper anregen sollen, indem Energie durch die Impulse auf die Zellen übertragen wird. Kleinsche Felder generieren ebenfalls ein schwache s Magnetfeld, das jedoch nicht pulsiert, sondern permanent vorhanden ist. Zurückzuführen ist dies auf Positiv – und Negativpole mit einer Größe von wenigen Millimetern, die schachbrettartig angeordnet sind. Durch die ständig w e chselnde Polung der Magnete wi rd ein schwaches Magnetfeld erzeugt, das inhomogen bzw. polymorph ist. Dieses Feld kann aufgrund seiner Statik keine Wechselwirkungen mit stationären Strukturen eingehen. Nur bewegliche Strukturen im Körper wie Blut oder Lymphe, die sich über ein solches p ermanentes polymorphes Magnetfeld bewegen, erfahren einen elektromagnetischen Einfluss. 1.2. Mitochondrien Da jede Zelle im Zuge ihrer spezifischen Stoffwechselreaktionen ATP verbraucht, muss dieses kontinuierlich in den Mitochondrien aufgebaut werden. Jede Zelle ist energetisch autonom und produziert die Menge an Energie, die sie benötigt. In allen Mitochondri en laufen die gleichen Prozesse ab, jedoch kann die Anzahl an Mitochondrien abhängig vom Zelltyp und somit die Menge an bereitgestellter Energie 4 variieren. Der strukturelle Aufbau eines Mitochondriums ist in Abbildung 1 dargestellt. Mitochondrien besitzen ebenso wie der Zellkern eine Doppelmembran. Zwischen der Außen – und der Innenmembran befindet sich ein Intermembranraum, der auch als perimitochondrialer Spalt bezeichnet wird. Ionen und kleine Moleküle können durch die äußere Membran diffundieren, wohinge gen ein Transport durch die Innenmembran nur über spezifische Proteine (Carrier) möglich ist. Sauerstoff (O 2 ) und Kohlenstoffdioxid (CO 2 ) können beide Membranen ungehindert passieren. Das für die Prozesse der Energiegewinnung benötigte Pyruvat wird aus dem Cytosol mittels eines Pyruvat – Shuttles durch die innere Mitochondrienmembran geschleust. Der Austausch von ADP und ATP durch die Innenmembran erfolgt über einen Antiporter. Der Innenraum des Mitochondriums (Mitochondrien – Matrix) wird durch die innere Memb ran umschlossen, die mehrere Einstülpungen (Cristae) in die Matrix besitzt. Die Membran der Cristae wird von ATP – Synthasen und weiteren Membranproteinen durchspannt, die an der Synthese des ATP beteiligt sind. Abbildung 1 : Struktureller Aufbau eines Mitochondriums (Boujard et al. 2014) Die Energiegewinnung in Mitochondrien besteht aus mehreren hintereinandergeschalteten Prozessen (s. Abbildung 2 ). Im M atrixraum wird das aus der im Cytosol bei der Glykolyse gebildete Pyruvat (Brenztraubensäure) weiterverarbeitet, bevor es in den Tricarbonsäure – Zyklus (Citrat – Zyklus) einfließt. Unter der Abspaltung von CO 2 (Decarboxylierung) und Wasserstoff (H; Oxidation) entsteht aus dem Pyruvat Acetat (Essigsäure), das mit Coenzym A (CoA) den Acetyl – CoA – Komplex bildet. Der freigewordene Wasserstoff würde mit dem in der Matrix 5 gelösten Sauerstoff in einer Knallgas – Reaktion verpuffen und die Zelle zerstören, weswegen die H – Atome an vorhandenes NAD + binden und dieses zu NADH reduzieren. Acetyl – CoA tritt nun in den Citrat – Zyklus ein, indem es eine Bindung mit dem vier Kohlenstoffatome enthaltenen Oxalacetat eingeht, bei der erneut eine Reduktion von NAD + stattfindet. Es entst eht Citrat (Zitronensäure), das sechs Kohlenstoffatome besitzt. Citrat wird decarboxyliert und NAD + anschließend reduziert. Die dabei entstandene α – Ketoglutarsäure wird durch wiederholte Reduktion von NAD + und Decarboxylierung zu Succinat (Bernsteinsäure), aus dem über weitere Zwischenstufen wieder Oxalacetat gebildet wird. Das anfallende CO 2 wird aus den Mitochondrien exportiert. Somit gehen aus der Umwandlung eines Pyruvat – Moleküls vier NADH – Moleküle hervor, die den nächsten Schritt bei der Energiegewinnu ng einleiten. Abbildung 2 : Schematische Darstellung des Tricarbonsäure – Zyklus (Plattner und Hentschel 2011) In der Cristae – Membran kommt es nun zur oxidativen Phosphorylierung, die auch Zellatmung genannt wird. Dargestellt ist dies in Abbildung 3 . Gek oppelt an die 6 Verwertung von O 2 wird ATP generiert. Die NADH – Dehydrogenase stellt das Ziel der in der Matrix befindlichen NADH – Moleküle dar. Sie oxidiert ein Molekül NADH zu NAD + , einem Proton (H + ) und einem Elektron (e – ). Das Elektron wird von einem Cytoc hrom aufgenommen und in einer Kette von Cytochromen weitergegeben (Atmungskette). Cytochrome besitzen in ihrer Häm – Gruppe ein Eisenatom, das bei Eintritt eines Elektrons seine Wertigkeit von Fe 3+ zu Fe 2+ ändert und bei Abgabe eines Elektrons wieder zu Fe 3+ . Der Elektronentransport durch die Atmungskette mündet in der Cytochromoxidase. Sie entlässt die Elektronen wieder in die Matrix und verknüpft diese zusammen mit Protonen und Sauerstoff zu Wasser (H 2 O). Der entscheidende Mechanismus der Atmungskette beste ht im indirekten Transport von Protonen in den perimitochondrialen Spalt, da diese den Elektronen hinterherdiffundieren. Hierbei handelt es sich um eine chemo – osmotische Kopplung, bei der aus der Verarbeitung organischer Substrate osmotische Energie in For m eines Protonengradienten hervorgeht. Die Protonen sammeln sich im Intermembranraum an, da sie weder die Innenmembran in Richtung Matrix passieren können, noch durch die Cytochromoxidase gelangen. Der entstandene H + – Gradient kann nur über den Transport de r Protonen in die Matrix durch die ATP – Synthasen aufgelöst werden. Dieser Vorgang stellt eine osmo – chemische Kopplung dar, da die Aufhebung des Gradienten eine Substrat – Synthese bewirkt. Die ATP – Synthasen funktionieren wie eine Turbine, bei der die Protone n eine Art Rotor antreiben, der sich auf der Matrix – Seite befindet. Durch reversible Konformationsänderungen wandelt sich die Bewegungsenergie in chemische Energie um, die ATP aus ADP und P i synthetisiert (Plattner und Hentschel 2011; Boujard et al. 2014) . Abbildung 3 : Darstellung der oxidativen Phosphorylierung (Plattner und Hentschel 2011) 7 1.3. Bioenergetischer Gesundheitsindex Der Bioen ergetische Gesundheitsindex ( Bioenergetic Health Index – BHI ) gibt Auskunft über den Gesundheitszustand von Mitochondrien. Diese Beurteilung der mitochondrialen Bioenergetik kann als eine Art Frühwarnsystem des Körpers eingesetzt werden, da viele Erkrankun gen mit Dysfunktionen der Mitochondrien einhergehen und inflammatorische Prozesse in Zellen des Immunsystems einen erhöhten Energiebedarf besitzen. Der BHI stellt somit einen Biomarker dar, der Erkenntnisse über mögliche Beschwerden oder Krankheiten dadurc h liefern kann, dass das metabolische Potential der Zellen über ihre Mitochondrien bestimmt wird (König 2016) . Der Test der Mitochondrien erfolgt mith ilfe chemischer Modulatoren, die Einfluss auf die Atmungskette nehmen. Gemessen wird die mitochondriale Atmung über die Sauerstoffverbrauchsrate ( Oxygen Consumption Rate – OCR ) während der aufeinanderfolgenden Zugabe dreier Substanzen zu den untersuchten Z ellen. Zunächst gelangt Oligomycin in den perimitochondrialen Spalt und inhibiert dort die ATP – Synthase. Der angestaute Protonen – Gradient kann sich nicht auflösen und führt dazu, dass keine weiteren Elektronen durch die Cytochromkette transportiert werden. Die Cytochromoxidase arbeitet nicht und verbraucht keinen Sauerstoff; der OCR fällt ab. Anschließend erhalten die Zellen den Entkoppler FCCP (Carbonyl cyanide – p – trifluoromethoxyphenylhydrazone), der in Lage ist, Protonen durch die mitochondriale Innenmemb ran zu schleusen. Die Protonen im Intermembranraum fließen in die Matrix und die Elektronentransportkette der Cytochrome wird wieder in Gang gesetzt. Die Cytochromoxidase läuft auf voller Kapazität, was zu einer Steigerung des OCR führt. Zuletzt werden die Zellen einer Mischung aus Rotenone und Antimycin A ausgesetzt. Rotenone inhibiert die NADH – Dehydrogenase und Antimycin A fungiert als Inhibitor des Komplex III der Cytochromkette. Die Zellatmung wird gestoppt und der OCR sinkt wieder. 8 Abbildung 4 : Modellverlauf der Oxygen Consumption Rate (OCR) über die Zeit (Agilent Technologies) Wie i n Abbildung 4 zu sehen ist , ergibt sich ein Modellverlauf des OCR über die Zeit mit den markierten Punkten der Zugabe der Modulatoren. Anfangs wird ein Normalzustand der Zellen gemessen, den die Basalatmung ( Basal Respiration ) widerspiegelt. Sie gibt Auskunft über den Energiebedarf der Mitochondrien, der unter normalen Bedingungen gedeckt wird. Die zelleigene ATP – Produktion ( ATP Production ) kann als Differenz des OCR vor und nach der Inhibierung durch Oligomycin bestimmt werden. ATP – Produktion und Protonenleck ( Proton Leak ) ergeben z usammen die Basalatmung. Das Protonenleck steht hierbei für die Menge verbrauchter Elektronen, die ohne Produktion von ATP durch die Cytochromoxidase mit Sauerstoff umgesetzt werden. Der Anstieg des OCR über die Basalatmung hinaus nach Zugabe von FCCP führ t zur Maximalatmung ( Maximal Respiration ), die das maximal mögliche Potential der mitochondrialen Atmung darstellt. Die Differenz zwischen Maximalatmung und ATP – Produktion bildet die Reserveatmungskapazität ( Spare Capacity ). Sie beschreibt die Fähigkeit de r Mitochondrien, bei zusätzlicher Energieanforderung Energie bereitzustellen. Alle Prozesse der Zelle, die Sauerstoff nicht im Zuge der Energieproduktion verbrauchen werden als nicht – mitochondriale Atmung ( Non – mitochondrial Oxygen Consumption ) bezeichnet. Sie lässt sich durch den OCR nach Beendigung der Zellatmung bestimmen (Agilent Technol ogies) . 9 Der BHI kann nun mit folgender Formel berechnet werden (Chacko et al. 2014) : 퐵퐻퐼 = log 푅푒푠푒푟푣푒푎푡푚푢푛푔푠푘푎푝푎푧푖푡 ä 푡 푥 퐴푇푃 − 푃푟표푑푢푘푡푖표푛 푛푖푐 ℎ 푡 − 푚푖푡표푐 ℎ 표푛푑푟푖푎푙푒 퐴푡푚푢푛푔 푥 푃푟표푡표푛푒푛푙푒푐푘 (1) Ein niedriger BHI deutet auf eine mögliche Fehlfunktion der Mitochondrien hin, die sich durch eine geringe ATP – Produktion und Reserveatmungskapazität, sowie ein erhöhtes Protonenleck äußert. Im Gegensatz dazu steht ein hoher BHI für gesunde Mitochondrien mit einem guten metabolischen Potential. 10 2. Material und Me thoden 2.1. Materialien Hersteller Artikelnummer Pipetten peqPETTE 1000E (100 – 1000 µl) peqlab Biotechnologie GmbH 103820032 peqPETTE 200E (20 – 200 µl) peqlab Biotechnologie GmbH 162330020 peqPETTE 10E (0,5 – 10 µl) peqlab Biotechnologie GmbH 48379 peqMATE peqlab Biotechnologie GmbH 103820032 SEROLOGICAL PIPETTE 5 ml und 10 ml SARSTEDT 861253001 861254001 Pipettenspitzen Top – Line 100 – 1000 µl AH N Biotechnologie GmbH 1 – 201 – 50 – 0 Top – Line 1 – 200 µl AH N Biotechnologie GmbH 1 – 111 – 60 – 0 Top – Line 0,5 – 10 µl SARSTEDT 70.1115 Reaktionsgefäße/Zellkulturröhrchen Reaktionsgefäße 1,5 ml Eppendorf AG 0030120086 Reaktionstubes 50 ml (steril) SARSTEDT 62.547.254 Reaktionstubes 15 ml (steril) SARSTEDT 62.544.502 11 Zellkulturflaschen CELLSTAR Zellkulturflasche, 50ml, 25cm 2 , Filterschraubverschluss (T25 – Flasche, rote Kappe) Greiner Bio – One 690175 CELLSTAR Suspensionskulturflasche, 50ml, Filterschraubverschluss (T25 – Flasche, weiße Kappe) Greiner Bio – One 690195 CELLSTAR Zellkulturflasche, 250ml, 75cm 2 , Filterschraubverschluss (T75 – Flasche, rote Kappe) Greiner Bio – One 658175 CELLSTAR Suspensionskulturflasche, 250ml, Filterschraubverschluss (T75 – Flasche, weiße Kappe) Greiner Bio – One 658195 Zählkammer Cellometer Counting Chambers Nexcelom Bioscience/peqlab Biotechnologie GmbH 91 – CMCCP – 01 Seahorse XFp Assay Cartridge Seahorse Bioscience 103022 – 100 XFp Cell Culture Miniplate Seahorse Bioscience 103025 – 100 XFp Cell Mito Stress Test Kit Seahorse Bioscience 103010 – 100 12 2.2. Reagenzien und Medien Chemikalien Hersteller Artikelnummer 1 0 xPBS – Lösung (40g/l NaCl; 7g/l Na 2 HPO 4 x 2H 2 O; 1g/l KCl; 1g/l KH 2 PO 4 ) MMD Labor VE – H 2 O MMD Labor RPMI Medium 1640 1x gibco® 21875 – 034 RPMI 1640 Medium MMD Labor 2,5 M D – Glucose Roth X997.2 Poly – D – lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407 – 5mg Sodium Pyruvate 100mM (100x) Gibco by Life Technologies 11360 – 039 Fetal Bovine Serum (FBS) performance plus gibco® 10082 – 147 Penicillin – Streptomycin (10000 U/ml) gibco® 15140 – 122 Phorbol – 12 – myristat – 13 – acetat (PMA) InvivoGen tlrl – pma Trypsin – EDTA (0,25%) gibco® 25200 – 072 Cellometer AO/PI Staining Solution in PBS Nexcelom Bioscience/peqlab Biotechnologie GmbH CS201065ML Calibrant pH = 7,4 (100 ml – 500 ml) Seahorse Bioscience 100840 – 000 Das RPMI 1640 Medium muss vor der weiteren Benutzung mit den Zellen vorbereitet werden. Hierzu werden zwei verschiedene Medien angesetzt; RPMI – Mess und RPMI – KM. RPMI – Mess wird zum Waschen von Zellen und für Untersuchungen der Zellen genutzt, wohingegen RPMI – KM ein Komplettmedi um darstellt und als Nährmedium für das Wachstum der Zellen dient. In der folgenden Tabelle ist die Herstellung der beiden Medien zu finden: 13 Medium Zusammensetzung RPMI – Mess 500ml RPMI 1640 Medium + 5ml 100mM Sodium Pyruvat + 2ml 2,5M D – Glucose RPMI – KM 500ml RPMI 1649 Medium + 50ml FBS + 5ml Penicillin – Streptomycin 2.3. Geräte Hersteller Sicherheistwerkbänke SterilwerkbankHERA safe Heraeus INSTRUMENTS SterilwerkbankHERA safe Heraeus INSTRUMENTS Zentrifugen SorvallLynx 6000 Thermo Scientific PerfectSpin 24 R peqlab Biotechnologie GmbH Inkubatoren Inkubator mit CO 2 BINDER GmbH Inkubator ohne CO 2 Binder GmbH, APT.line TM ED (E2) Sonstige Geräte peqTWIST Vortex Mixer peqlab Biotechnologie GmbH Cellometer Vision NexcelomBioscience Seahorse XFp Analyzer Agilent Technologies 14 2.3.1. Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience) Der Cellometer Vision ist ein Gerät der Firma Nexcelom Bioscience , mit dem Zellzählungen an einem angeschlossenen Computer vorgenommen werden können. Hierfür werden Zellzählkammern genutzt, von denen immer zwei auf einem vorgefertigten Objektträger liegen. Dieser wird in die Vorderseite des Gerätes gesteckt, sodass eine Zellzählkammer ausgelesen wird. Gefüllt wird jede Kammer mit 20 µl einer zuvor angesetzten Mischung aus 20µl Zellsuspension und 5µl AO/PI. AO/PI ist ein Reagenz, das aus Acridin Orange (AO) und Propidium Iodid (PI) besteht. AO generiert grüne Fluoreszenz und ist in der Lage, an Nucleinsäuren zu binden. Es diffundiert in lebende und tote Zellen und färbt jede Zelle mit einem Zellkern ein. PI bindet ebenfalls an Nukleinsäuren, ist aber im Gegensatz zu AO nicht membrandurchlässig. Nur tote Zellen, deren Zellmembran deformiert ist, nehmen das PI auf, welches dann an die DNA bindet. PI erzeugt rote Fluoreszen z (Mas cotti et al. 2000) . Über die Abtastung der Probe mit zwei unterschiedlichen Kameras hintereinander werden alle lebenden (grün) und toten Zellen (rot) gezählt. Das zum Cellometer Vision gehörige Computerprogramm erfordert die Eingabe des zu untersuchende n Zelltyps und eines Verdünnungsfaktors, der sich aus dem zugegebenen Volumen in der Zellkammer geteilt durch das dafür eingesetzte Volumen der Zellsuspension ergibt. Werden die 20µl unverdünnt aus einer Zellsuspension genommen , ergibt sich somit ein Fakto r von 1,25. Neben der Anzahl lebender und toter Zellen gibt das Programm auch die Viabilität, den durchschnittlichen Durchmesser der Zellen sowie die Zellkonzentration je ml an. Abschließend kann das Programm bei Bedarf berechnen, inwiefern das Volumen der Zellsuspension, aus dem die Probe entnommen wurde, eingestellt werden muss, um eine gewünschte Zellkonzentration je ml zu erhalten . 15 2.3.2. Seahorse XFp Analyzer (Agilent Technologies) Bei dem Seahorse XFp Analyzer der Firma Agilent Technologies handelt e s sich um einen Extracellular Flux Analyzer , der Veränderungen von Zellen detektiert. Das Gerät injiziert verschiedene Reagenzien hintereinander in ein Medium, in dem sich Zellen befinden. Die Reaktionen der Zellen auf die Reagenzien werden über die Veränd erung der Sauerstoffkonzentration ( Oxygen Consumption Rate, OCR ), der extrazellulären Ansäuerungsrate ( Extracellular Acidification Rate, ECAR ) und des pH – Wertes im Medium gemessen. Zur Verfügung stehen mehrere Kits des Herstellers für verschiedene Frageste llungen . Mit Hilfe des XFp Cell Mito Stress Test Kit kann die mitochondriale Atmung untersucht werden. Die funktionale Messung der Mitochondrien lässt Aussagen über die Zellen zu zellulärer Aktivität, Proliferation, Differenzierung und Dysfunktion zu. Olig omycin, FCCP und eine Mischung aus Rotenone und Antimycin A werden als Reagenzien eingesetzt und agieren als Inhibitoren mehrerer Komplexe der Atmungskette. Gemessen werden über die Oxygen Consumption Rate (OCR) die ATP – Produktion, die maximale Atmung und die nicht – mitochondriale Atmung. Hieraus werden anschließend noch die Basalatmung, das Protonenleck und die Reserveatmungskapazität bestimmt. 2.4. Vorbereitungen für Untersuchungen von Zellen im Seahorse Um Versuche mit dem Seahorse durchzuführen müssen bereits einen Tag zuvor Vorbereitungen getroffen werden. Standardmäßig werden für alle Untersuchungen mit dem XFp Cell Mito Stress Test Kit zwei mitgelieferte Materialien eingesetzt; eine Mikrokulturplatte mit Deckel für die zu unters uchenden Zellen und eine Cartridge für die Injektion der gewünschten Reagenzien. Die Mikrokulturplatte besteht aus acht länglichen Vertiefungen außen, Mouts genannt, und acht runden Wells in der Mitte. Die Wells werden mit je 25µl Poly – D – Lysin (PDL) befüll t. PDL ist eine synthetische Verbindung zur Förderung der Zelladhäsion. Die Platten werden zwecks Beschichtung mit PDL für 1 – 2 Stunden inkubiert. Anschließend werden alle Wells mit einer Pipette geleert und mit je 500µl autoklaviertem VE – H 2 O gewaschen. Dan ach bleibt die Platte zum Trocknen für mindestens eine Stunde oder alternativ über Nacht 16 offen stehen. Die Cartridge besteht ebenfalls aus einer Platte mit je acht Wells und Mouts sowie einem sensorischen Aufsatz für die Reagenzien und einem Deckel. In jed es Well werden 200µl Calibrant und in die einzelnen Mouts 400µl Calibrant gegeben. Calibrant dient der Kalibrierung der Sensoren im Seahorse vor jedem Test. Die befüllten Mouts wirken der Verdampfung der Flüssigkeit in den Wells entgegen. Das Calibrant in den Wells befeuchtet außerdem die Sensoren im Aufsatz (Hydratisierung). Die Cartridge wird anschließend über Nacht in einen Inkubator gestellt (37°C, ohne CO 2 ). Die hydratisierte Cartridge wird am nächsten Tag mit den einzusetzenden Reagenzien befüllt. Fü r den Mito Stress Test werden dem mitgelieferten Kit die drei Tubes mit Oligomycin, FCCP und Rotenone/Antimycin A entnommen. Entsprechend der nachfolgenden Tabelle werden die als Pulver vorliegenden Substanzen in RPMI – Mess gelöst, um stabile Stocklösungen herzustellen. Tabelle 1 : Stocklösungen Lösungsvolumen Konzentration Oligomycin 252µl 50µM FCCP 288µl 50µM Rotenone/Antimycin A 216µl 25µM Aus den Stocklösungen werden mit RPMI – Mess nun verdünnte Arbeitslösungen hergestellt, die nur begrenzt stabil sind. In Tabelle 2 ist das Pipettierschema dargestellt. Tabelle 2 : Arbeitslösungen Stockvolumen Lösungsvolumen Konzentration Oligomycin 120µl 180µl 20µM FCCP 90µl 210µl 15µM Rotenone/Antimycin A 100µl 150µl 10µM 17 Der Sensoraufsatz der Cartridge besitzt für jedes Well vier Ports, die mit A, B, C und D beschriftet sind. In jeden Port wird ein Reagenz pipettiert, sodass später alle drei Reagenzien in jedes einzelne Well injiziert werden können; Port D bleibt dabei leer. Tabelle 3 : Befüllung Sensor Port Volumen Konzentration je Well Oligomycin A 20µl 2,0µM FCCP B 22µl 1,5µM Rotenone/Antimycin A C 25µl 1µM Die Konzentrationen je Well ergeben sich aus den Volumina der Reagenzien, die während des Tests im Seahorse zu den sich im Medium befindlichen Zellen hinzugegeben werden. Im Folgenden sei dies an einem Beispiel erklärt: I n jedem Well befinden sich 180µl Ze llsuspension, zu der Oligomycin injiziert werden soll, sodass die Endkonzentration von Oligomycin in der Zellsuspension 2,0µM beträgt. Dies entspricht einem Zehntel der Konzentration der Arbeitslösung von Oligomycin. Folglich stellen die 180µl Zellsuspensi on 90% des Gesamtvolumens dar. 180µ 푙 90% 푥 100% = 200µ 푙 ( 2 ) Demzufolge beträgt das Injektionsvolumen von Oligomycin 20µl, die aus der Arbeitslösung entnommen werden. Für FCCP und Rotenone/Antimycin A erfolgt die Berechnung analog, wobei beachtet werden muss, dass die Reagenzien nacheinander injiziert werden, sodass das Gesamtvolumen stetig ansteigt. Die fertig vorbereitete Cartridge wird ohne Deckel in den Seahorse gestellt und das Programm für den Mito Stress Test gestartet. Nach der ca. 20 – minü tigen Kalibrierung wird der Sensoraufsatz mit den Reagenzien im Gerät zurückgehalten und nur die untere Platte wird ausgegeben. Diese wird entnommen und gegen die Mikrokulturplatte mit den Zellen ausgetauscht. Der Seahorse startet daraufhin den eigentliche n Test. Alle vom Gerät gemessenen Werte werden automatisch in einer Excel – Datei gespeichert, die dann am Computer weiter verarbeitet werden kann. 18 2.5. Anzucht von Zellen aus der Kryokultur Aus dem im Labor befindlichen Stickstofftank wurden zwei Kryotubes mit je 1ml THP – 1 – Zellen entnommen, deren Zellkonzentration 5×10 6 Zellen/ml beträgt. In jedes Tube werden 1ml RPMI – KM gegeben. Durch Auf – und Abpipettieren werden die Zellsuspensionen homogenisiert, bevor sie in 15ml Tubes überführt und dann bis auf 15ml mit R PMI – KM aufgefüllt werden. Bei 300xg wird für fünf Minuten zentrifugiert und die Überstände verworfen. Zum Waschen werden die Pellets in 1ml PBS resuspendiert und auf 15ml mit PBS aufgefüllt. Erneut wird für fünf Minuten bei 300xg zentrifugiert. Dieser Wasc hschritt wird wiederholt. Die Überstände werden verworfen, die Pellets in 1ml RPMI – KM resuspendiert und dann auf 5ml mit RPMI – KM aufgefüllt. Nun erfolgt eine Zellzählung mittels AO/PI – Färbung im Cellometer Vision . Die Zellzahlkonzentrationen in den beiden T25 – Flaschen (weiße Kappen; jeweils 10 ml Volumen) werden auf je 5×10 5 Zellen/ml eingestellt. Um das Wachstum der Zellen nach dem Auftauen zu unterstützen wird 1ml Fetal Bovine Serum (FBS ; Endkonzentration 10% ) zu jeder Flasche gegeben. Bei 37°C und 5% CO 2 inkubieren die Zellen im Brutschrank. Nach 48 Stunden wird ein Wechsel des Mediums vorgenommen. Die Zellsuspensionen der beiden T25 – Flaschen werden in einem 50ml Tube gepoolt und bei 250xg für zehn Minuten zentrifugiert. Die Zellen werden mit PBS gewasch en (s. o.). Nach dem Resuspendieren mit 1ml RPMI – KM werden die Zellen auf 5ml aufgefüllt und mittels AO/PI – Färbung im Cellometer Vision gezählt. Die Zellzahl wird auf 1×10 5 Zellen/ml eingestellt und das Volumen in eine T75 – Flasche (weiße Kappe) überführt. Die Flasche wird bei 37°C und 5% CO 2 in den Inkubator gestellt. Nach 72 Stunden sind die Zellen ausreichend gewachsen, damit mit ihnen gearbeitet werden kann. 19 2.6. Kultivierung und Pflege der Zellen Die THP – 1 – Zellen wachsen stets in T75 – Flaschen bei 37° C und 5% CO 2 im Inkubator. Einmal pro Woche (Freitag) werden die Zellen gewaschen und in neuem Medium resuspendiert . Hierfür wird das gesamte Volumen einer T75 – Flasche (ca. 40ml) in eine 50ml Tube gefüllt und bei 250xg für zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 1ml PBS aufgenommen. Nach dem Auffüllen mit PBS auf 10ml wird erneut für zehn Minuten bei 250xg zentrifugiert. Der Waschschritt wird wiederholt. Der Überstand wird wieder verworfen, das Pellet in 1ml RPMI – KM resuspendiert und auf 10ml aufgefüllt. Die Zellzahl wird mittels AO/PI – Färbung im Cellometer Vision bestimmt und auf 1×10 5 Zellen/ml eingestellt. Die Zellen werden dann in die T75 – Flasche (20ml) gefüllt. Auf die Flasche wird die Numm er der Passage und das Datum geschrieben, damit nachvollzogen werden kann, aus welcher Passage die Zellen stammen, mit denen gearbeitet wurde. An zwei weiteren Tagen in der Woche (Montag und Mittwoch) werden je 10ml RPMI – KM zu den Zellen in die T75 – Flasche gegeben, um die Zellen zu füttern. Eine T75 – Flasche wird stets als Erhaltung mitgeführt, während bei Bedarf für anstehende Untersuchungen wie der Stimulation der Zellen eine extra T75 – Flasche während des Passagierens angesetzt wird. THP – 1 – Zellen, die mit Hilfe von Phorbol – 12 – myristat – 13 – acetat (PMA) zu adhärenten Zellen ausdifferenziert werden, benötigen eine gewisse Vorlaufzeit, bevor mit ihnen gearbeitet werden kann. Während des wöchentlichen Mediumswechsels wird eine für adhärente Zellen geeignete T75 – Flasche (rote Kappe) angesetzt. Sie besitzt eine extra Beschichtung, die das Anheften der Zellen unterstützt. Nach der Zellzahlbestimmung werden die Zellen mit einer Konzentration von 5×10 5 Zellen/ml in RPMI – KM aufgenommen, sodass sich in der Flasche ein G esamt volumen von ungefähr 30ml befindet. Dieses Volumen setzt sich aus den gewaschenen und in RPMI – KM aufgenommen Zellen, zusätzlichem RPMI – KM und dem anzusetzenden PMA zusammen. Das aliquotierte und bei – 20°C im Tiefkühlschrank gelagerte PMA (5mg/ml) muss verdünnt werden, bevor es zu den Zellen gegeben werden kann; andernfalls wäre die Dosierung zu hoch und die Zellen würden zu stark vorstimuliert werden oder würden sogar sterben. Nachfolgend ist die PMA – Verdünnungsreihe dargestellt: 20 Verdünnung 1: 10 휇푙 푃푀퐴 + 90 휇푙 푅푃푀퐼 − 퐾푀 Verdünnung 2: 50 휇푙 푉푒푟푑 . 1 + 450 휇푙 푅푃푀퐼 − 퐾푀 Verdünnung 3: 50 휇푙 푉푒푟푑 . 2 + 450 휇푙 푅푃푀퐼 − 퐾푀 Verdünnung 4: 100 휇푙 푉푒푟푑 . 3 + 900 휇푙 푅푃푀퐼 − 퐾푀 Allgemein kommen auf 10ml Medium 100µl PMA der Verdünnun g 4 (5ng/ml) . In die T75 – Flasche wird das RPMI – KM vorgelegt, ehe die entsprechende Menge PMA (ca. 300µl) hinzugegeben wird. Die Suspension wird durch vorsichtiges Hin – und Herschwenken homogenisiert. Danach werden die Zellen hinzugegeben. Die fertige Flasc he wird mit „PMA – Zellen“ und dem Datum des Ansetzens beschriftet und in den Inkubator bei 37°C und 5% CO 2 gelegt. 2.7. Stimulation der Zellen mit Magnetstreifen Die Stimulation der Zellen erfolgte auf einer selbst gebauten Vorrichtung mit einem speziellen Magnetstreifen der Firma BIORELAX bzw. einem Mock – Magnetstreifen , der in Abbildung 5 zu sehen ist . Die Magnetstreifen bestehen aus sich ständig abwechselnden Pos itiv – und Negativpolen. Durch eine kontinuierliche Hin – und Herbewegung de r Magnetstreifen unter den Zellen werden Kleinsche Felder induziert, die zur Stimulierung der Zellen genutzt wurden. Die Vorrichtung besteht aus zwei sich bewegenden Streifen, von de nen nur einer die Magnetfelder erzeugt, während der andere Streifen (Mock – Magnetstreifen) keinerlei Wirkung hat und als Negativkontrolle (NTC) mitgeführt wurde. Über den Streifen befindet sich jeweils eine kleine arretierte Metallplatte, auf der die T25 – Fl aschen mit den zu untersuchenden Zellen gelegt wurden. Die gesamte Vorrichtung befindet sich im Brutschrank (37°C, 5% CO 2 ) und ist mit einem Faden mit einem außerhalb des Inkubators stehenden Motor verbunden. Dieser dreht sich, wodurch der Faden hin – und h ergezogen wird und die beiden Streifen im Inkubator unter der Metallplatte bewegt. 21 Abbildung 5 : Magnetstreifen der Firma BIORELAX Da sowohl THP – 1 – als auch PMA – differenzierte Zellen in T75 – Flachen wachsen, müssen die Zellen für die Versuche gewaschen, gezählt und in T25 – Flaschen überführt werden. Grund ist die begrenzte Fläche der Metallplatte, die durch die Bewegung der Streifen abgedeckt werden kann. Das Waschen der Zellen er folgt unter den gleichen Bedingungen wie beim Passagieren. Nach der Zellzahlbestimmung werden zwei T25 – Flaschen ( 5 – 10ml ) mit einer Konzentration von 5×10 5 Zellen/ml angesetzt. Eine Flasche wird mit „NTC“ und die andere mit „Stimulation“ beschriftet. Dann w erden die Flaschen über die entsprechenden Streifen ( Mock – Magnetstreifen bzw. Magnetstreifen ) auf die Metallplatte gelegt und die Stimulation wird gestartet. Die PMA – differenzierten Zellen wurden dienstags untersucht. Nachdem die Zellen übers Wochenende d ifferenziert wurden , erfolgte am Montag das erste Ernten der Zellen. Hierbei werden die Zellen aus der T75 – Flasche entnommen, gewaschen und auf zwei T25 – Flaschen (rote Kappe) aufgeteilt. Da sich die Zellen am Boden der Flasche angeheftet haben , wird zuerst vorsichtig das gesamte Medium über die nicht bewachsene Seite der Flasche abgegossen und verworfen. Dann werden 5ml PBS langsam in die Flasche gegeben. Die Flasche wird etwas geschwenkt, um noch eventuell vorhandenes Medium abzuspülen. Das PBS wird anschl ießend verworfen. Nun werden 2ml Trypsin in die Flasche pipettiert, um die Zellen vom Boden abzulösen. Die Flasche wird für fünf Minuten in den Inkubator gelegt, wobei beachtet werden muss, dass der Boden vollständig mit Trypsin bedeckt ist. Nach der 22 Inkub ation wird die Flasche mit einer Hand festgehalten und mehrmals kräftig gegen die andere Hand geklopft. Die sich ablösenden Zellen sind als kleine weiße Klümpchen zu erkennen. Da das Trypsin bei längerer Einwirkung eine Schädigung der Zellen hervorrufen wü rde, werden 10ml RPMI – KM zur Inhibierung der Trypsinwirkung nach spätes te n s zehn Minuten in die Flasche gegeben. Mittels einer 10ml – Plastikpipette werden die Innenwände der Flasche mit dem RPMI – KM gespült, bevor die Zellsuspension aufgenommen und in ein 15 ml Tube überführt wird. Nach einer 10 – minütigen Zentrifugation bei 250xg werden die Zellen analog zu den THP – 1 – Zellen mit PBS gewaschen (s. o.). Anschließend werden die Zellen in 10ml RPMI – KM aufgenommen und im Cellometer Vision gezählt. Die Zellzahl wird auf 3×10 5 Zellen/ml eingestellt. In die T25 – Flaschen kommt ein Gesamtvolumen von 5ml, sodass sich die PMA – differenzierten Zellen anheften können. Über Nacht wachsen die Zellen im Inkubator bei 37°C und 5% CO 2 . Am nächsten Tag können die beiden Flaschen dan n auf die Vorrichtung zur Stimulation mit dem Magneten gelegt werden. 2.8. Aufarbeitung der Zellen für Untersuchungen im Seahorse Nach der Stimulation auf dem Magnetstreifen bzw. dem Mock – Magnetstreifen werden die in den T25 – Flaschen befindlichen THP – 1 – Zellen wieder gewaschen. Die Zentrifugationsbedingungen bleiben gleich; der Ablauf ändert sich nur dahingehend, dass kein PBS zum Waschen verwendet wird sondern RPMI – Mess. Die Zellzahl wird im Cellometer V ision ermittelt und für die Untersuchung im Seahorse auf 5×10 5 Zellen/ml eingestellt. Die PMA – differenzierten Zellen werden zum Ernten wieder mit Trypsin behandelt (s. o.) und ebenfalls mit RPMI – Mess gewaschen. Nach der Zellzahlbestimmung wird eine Konzent ration von 4×10 5 Zellen/ml eingestellt. Nun erfolgt die Überführung der stimulierten Zellen und der unstimulierten Zellen (NTC) in die Mikrokulturplatte. Die acht Wells sind mit A – H beschriftet. Die Wells A und H werden als Blank mitgeführt und enthalte n keine Zellen. Sie werden mit 100µl RPMI – Mess befüllt. In die Wells B, C und D werden jeweils 100µl Zellsuspension der stimulierten Zellen gegeben. Von der Negativkontrolle werden je 100µl in die Wells E, F und G pipettiert. Die Mouts werden mit je 400µl VE – H 2 O befüllt, um während der 23 Untersuchung im Seahorse eine Verdunstung der Zellsuspensionen zu verhindern. Dann wird die Mikrokulturplatte für fünf Minuten bei 300xg zentrifugiert, damit sich die Zellen möglichst gleichmäßig am Boden der Wells verteilen. Dies wird anschließend durch eine Betrachtung der Wells unter dem Mikroskop beurteilt, wobei zu notieren ist, ob die Zellen homogen oder inhomogen verteilt sind und wie groß die Konfluenz ist. Nun wird jedem Well 80µl RPMI – Mess hinzugefügt. Anschließend k ann die Mikrokulturplatte in den vorbereiteten und kalibrierten Seahorse gestellt werden und die Untersuchung gestartet werden. Auf eine statistische Betrachtung der Ergebnisse aller Untersuchungen wurde verzichtet, da jeder Versuch innerhalb dieses Pilot projektes nur einmal durchgeführt wurde. 24 3. Ergebnisse Im Folgenden sind die Ergebnisse der Versuchsläufe mit den THP – 1 – Suspensionszellen und den PMA – differenzierten THP – 1 – Zellen dargestellt. Für beide Zelltypen erfolgte vor de r Stimulation der Zellen auf dem Magnetstreifen bzw. dem Mock – Magnetstreifen ein Vorversuch zur Betrachtung des Ist – Zustandes der Zellen. Die THP – 1 – Zellen wurden beiden Magnetstreifen für eine, vier, acht und 24 Stunden ausgesetzt; die PMA – differenzierten Zellen wurden eine, vier und 24 Stunden lang stimuliert. 3.1. THP – 1 – Zellen 3.1.1. Vorversuch Vor der Stimulation mit dem Magnetstreifen wurden die THP – 1 – Zellen in der Passage 18 im Seahorse getestet, um herauszufinden, wie sich die Zellen unter den Kultivierungsbedingungen verhalten. Im Folg enden ist für die mitochondriale Atmung die Oxygen Consumption Rate (OCR) gegen die Zeit in Fünffachbestimmung aufgetragen. Abbildung 6 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min 0 50 100 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well 25 Die daraus resultieren den Werte der Basalatmung, des Protonenlecks, der Maximalatmung, der Reserveatmungskapazität, der nicht – mitochondrialen Atmung und der mitochondrialen ATP – Produktion sind mit den Mittelwerten, den Standardabweichungen und den Variatio nskoeffizienten in der Tabelle 4 und den Abbildung 7 und 8 zu sehen. Die Zellen in den fünf getesteten Wells (C – G) zeigen alle sehr ähnliche Verläufe des OCR, die nur im Bereich zwischen 40 und 55 Minuten, also nach der Zugabe von FCCP, geringfügig voneinander abweichen. Ta belle 4 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] Well C 37,73 3,42 82,75 45,01 24,32 34,31 Well D 39,18 2,98 89,82 50,63 25,01 36,21 Well E 46,67 4,12 100,88 54,20 25,66 42,55 Well F 37,99 3,80 91,22 53,23 28,50 34,18 Well G 45,92 6,97 74,34 28,42 22,94 38,95 Mittelwert 41,50 4,26 87,80 46,30 25,29 37,24 Standard – abweichung 4,42 1,58 9,92 10,61 2,06 3,54 Variationsko – effizient 10,65% 37,09% 11,30% 22,92% 8,15% 9,51% Die Standardabweichung des Protonenlecks ist im Vergleich zu den anderen Größen am geringsten, weist aber aufgrund des niedrigen Mittelwertes den höchsten Variationskoeffizienten auf. Dies lässt sich auch in Abbildung 7 erkennen, da beim Protonenleck Well G (türkise Säule) sichtbar von den anderen vier Wells abweicht und teils doppelt so hohe Werte annimmt wie die übrigen Wells. Ein ähnlicher Effekt ist ebenfalls durch Well G bei der Reserveatmungskapazität zu beobachten. Der Wert von 28,42 pmol/min weicht deutlich von denen der anderen Wells ab. Mit 22,92% ist hier der zweithöchste Variationskoeffizient zu verzeichnen. Nicht – 26 mitochondriale Atmung, mitochondriale ATP – Produktion, Basalatmung und Maximalatmung liegen mit Variationskoeffizienten zwischen 8,15% und 11,30% dicht beieinander. Abbildung 7 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion (dargestellt sind die fünf Einzelergebnisse in pmol O 2 /min) Abbildung 8 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale At mung und mitochondriale ATP – Produktion Die prozentuale Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz sind tabellarisch und graphisch nachfolgend dargestellt. 0 50 100 150 OCR (pmol/min) THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well 41,50 4,26 87,80 46,30 25,29 37,24 0 50 100 150 OCR (pmol/min) THP-1 Suspension 500000 Z/Well 27 Tabelle 5 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität u nd Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] Well C 219,30 90,93 Well D 229,21 92,40 Well E 216,14 91,16 Well F 240,14 89,99 Well G 161,89 84,81 Mittelwert 213,34 89,86 Standardabweichung 30,25 2,95 Variationskoeffizient 14,18% 3,28% Die Werte der Kopplungseffizienz sind für alle fünf Wells sehr homogen verteilt, was auch der niedrige Variationskoeffizient von 3,28% widerspiegelt. Bei der Reserveatmungskapazität liegt der Variationskoeffizient bei 14,18%, was durch den sichtbar geringeren Wert des Wells G (s. Abbildung 9 , türkise Säule) bedingt ist. Abbildung 9 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well THP-1 Suspension 500000 Z/Well 28 Abbildung 10 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Der Bioenergetische Gesundheitsindex ist in der folgenden Tabelle zu finden. Tabelle 6 : Vorversuch mit THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI Well C 1,27 Well D 1,39 Well E 1,34 Well F 1,22 Well G 0,84 Mittelwert 1,21 Standardabweichung 0,22 Variationskoeffizient 18,18% Mit Werten zwischen 1,22 und 1,39 liegt der BHI der Wells C bis F nah beieinander. Well G stellt mit einem BHI von 0,84 einen Ausreißer dar, der den erhöhten Variationskoeffizienten von 18,18% bewirkt. 213,34 89,86 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) THP-1 Suspension 500000 Z/Well 29 3.1.2. 1h Stimulation Nach einer Stunde Stimulation der Ze llen mit dem Magnetstreifen bzw. dem Mock – Magnetstreifen (NTC) ergab sich für die mitochondriale Atmung folgender Verlauf: Abbildung 11 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Der OCR der stimulierten Zellen (Well B – D) weist durchgehend höhere Werte als die zur Kontrolle mitgeführten Zellen auf dem Mock – Magnetstreifen (NTC) (Well E – G) auf. Die errechneten Größen der mitochondrialen Atmung sind in Tabelle 7 zu finden. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 1h Stimulation 1h Stimulation 1h Stimulation 1h NTC 1h NTC 1h NTC 30 Tabelle 7 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 1h Stimulation 148,87 22,61 478,89 330,02 48,17 126,26 1h Stimulation 133,43 20,65 516,47 383,04 51,54 112,78 1h Stimulation 134,90 27,13 504,81 369,92 41,52 107,77 1h NTC 83,64 13,55 118,37 34,73 25,56 70,09 1h NTC 86,63 12,49 182,04 95,41 26,08 74,13 1h NTC 89,42 14,58 156,66 67,24 24,83 74,84 Mittelwert 1h Stimulation 139,06 23,46 500,06 360,99 47,08 115,60 Standard – abweichung 8,52 3,32 19,24 27,62 5,10 9,56 Variationsko – effizient 6,13% 14,15% 3,85% 7,65% 10,84% 8,27% Mittelwert 1h NTC 86,56 13,54 152,36 65,79 25,49 73,02 Standard – abweichung 2,89 1,04 32,06 30,37 0,63 2,56 Variationsko – effizient 3,34% 7,69% 21,04% 46,16% 2,47% 3,51% Bei den stimulierten Zellen weisen das Protonenleck und die nicht – mitochondriale Atmung mit 3,32 bzw. 5,10 die geringsten Standardabweichungen auf. Wegen der vergleichsweise niedrigen Mittelwerte besitzen sie jedoch mit 14,15% bzw. 10,84% die beiden höchst en Variationskoeffizienten. Die Maximalatmung der stimulierten Zellen ergibt trotz der zweithöchsten Standardabweichung (19,24) den geringsten Variationskoeffizienten (3,85%), bedingt durch den hohen Mittelwert von 500,06. Basalatmung, Reserveatmungskapazi tät und mitochondriale ATP – Produktion liegen 31 mit Variationskoeffizienten zwischen 6,13% und 8,27% dicht beieinander. Die Negativkontrolle liefert für die nicht – mitochondriale Atmung, die Basalatmung und die mitochondriale ATP – Produktion sehr niedrige Varia tionskoeffizienten zwischen 2,47% und 3,51%. Mit den hohen Standardabweichungen von 32,06% bzw. 30,37% der Maximalatmung und der Reserveatmungskapazität gehen hohe Variationskoeffizienten von 21,04% bzw. 46,16% einher. Auffällig sind hierbei die vergleichs weise geringen Werte von Well E, die in Abbildung 12 deutlich zu erkennen sind (blaue Säule). Die Abbildungen 12 und 13 zeigen die graphische Auftragung der Größen aus Tabelle 7 . Abbildung 12 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 OCR (pmol/min) 1h Stimulation 1h Stimulation 1h Stimulation 1h NTC 1h NTC 1h NTC 32 Abbildung 13 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion Wie zuvor beim Verlauf der mitochondrialen Atmung in Abbildung 11 ist in Abbildung 13 für alle Größen deutlich zu sehen, dass die stimulierten Zellen im Vergleich zu den nicht – stimulierten Zellen höhere Werte aufweisen. Die Tabelle 8 sowie die Abbildungen 14 und 15 zeigen die Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz in Prozent mi t den jeweiligen Mittelwerten und Standardabweichungen sowie den Variationskoeffizienten. Tabelle 8 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffi zienz [%] 1h Stimulation 321,68 84,81 1h Stimulation 387,08 84,52 1h Stimulation 374,22 79,89 1h NTC 141,52 83,80 1h NTC 210,14 85,58 1h NTC 175,20 83,70 Mittelwert 1h Stimulation 361,00 83,08 Standardabweichung 34,65 2,76 Variationskoeffizient 9,60% 3,32% Mittelwert 1h NTC 175,62 84,36 Standardabweichung 34,31 1,06 Variationskoeffizient 19,54% 1,25% 139,06 23,46 500,06 360,99 47,08 115,60 86,56 13,54 152,36 65,79 25,49 73,02 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 OCR (pmol/min) 1h Stimulation 1h NTC 33 Sowohl bei den stimulierten als auch bei den unstimulierten Zellen weist die Kopplungseffizienz jeweils sehr homogene Werte auf. Dies ist auch anhand der niedrigen Variationskoeffizienten von 3,32% bzw. 1,25% zu sehen. Durch die Schwankungen der Wer te der Reserveatmungskapazität (v gl. Tabelle 8 und Abbildung 14 ) ergeben sich höhere Standardabweichungen und somit auch höh ere Variationskoeffizienten. Abbildung 14 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Abbildung 15 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Der Vergleich der Mittelwerte liefert für die stimulierten Zellen eine mehr als doppelt so große Reserveatmungskapazität wie für die Negativkontrolle. Die Kopplungseff izienz ist annähernd gleich. 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 1h Stimulation 1h Stimulation 1h Stimulation 1h NTC 1h NTC 1h NTC 361,00 83,08 175,62 84,36 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 1h Stimulation 1h NTC 34 Der Bioenergetische Gesundheitsindex für die stimulierten und nicht – stimulierten Zellen steht nachfolgend in Tabelle 9 . Tabelle 9 : 1h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 1h Stimulation 1,58 1h Stimulation 1,61 1h Stimulation 1,55 1h NTC 0,85 1h NTC 1,34 1h NTC 1,14 Mittelwert 1h Stimulation 1,58 Standardabweichung 0,03 Variationskoeffizient 1,88% Mittelwert 1h NTC 1,11 Standardabweichung 0,25 Variationskoeffizient 22,24% Die stimulierten Zellen besitzen mit 1,58 einen höheren BHI als die unstimulierten Zellen (1,11). Der niedrig ausfallende Wert des Wells E bewirkt zusammen mit der verhältnismäßig großen Streuung des BHI bei der Negat ivkontrolle einen hohen Variationskoeffizienten von 22,24%. 35 3.1.3. 4h Stimulation Für die THP – 1 – Zellen, die vier Stunden lang dem Magnetstreifen ausgesetzt waren, ergab sich folgender Verlauf der Mitochondrialen Atmung: Abbildung 16 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Die Werte des OCR der stimulierten Zellen sind durchgehend geringer als die vergleichbaren Werte der Negativkontrolle. Auffällig sind die Schwankungen bei der Maximalatmung, die bei den unstimulierten Zellen ungefähr doppelt so hoch ausfallen wie bei den stimulierten Zellen. Entsprechend ergeben sich für die Größen der mitochondrialen Atmung die Werte in Tabelle 10 . Graphisch dargestellt sind diese in d en Abbildungen 17 und 18 . 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 4h Stimulation 4h Stimulation 4h Stimulation 4h NTC 4h NTC 4h NTC 36 Tabelle 10 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 4h Stimulation 94,38 17,27 181,22 86,84 29,39 77,12 4h Stimulation 100,94 18,84 229,11 128,17 30,51 82,10 4h Stimulation 95,44 16,57 182,80 87,36 31,10 78,87 4h NTC 198,78 39,89 366,17 167,39 53,94 158,89 4h NTC 179,94 37,75 330,41 150,47 51,78 142,19 4h NTC 191,35 49,59 273,24 81,89 50,16 141,76 Mittelwert 4h Stimulation 96,92 17,56 197,71 100,79 30,34 79,36 Standard – abweichung 3,52 1,16 27,21 23,72 0,87 2,53 Variationsko – effizient 3,63% 6,60% 13,76% 23,53% 2,86% 3,19% Mittelwert 4h NTC 190,02 42,41 323,27 133,25 51,96 147,61 Standard – abweichung 9,49 6,31 46,87 45,28 1,89 9,77 Variationsko – effizient 4,99% 14,88% 14,50% 33,98% 3,65% 6,62% Die stimulierten Zellen weisen bei der Maximalatmung und der Reserveatmungskapazität die höchsten Standardabweichungen (27,21 bzw. 23,72) und die höchsten Variationskoeffizienten (13,76% bzw. 23,53%) auf. Auffällig ist hier Well C, dessen Werte für die beiden Größen stark nach oben abweichen und für die anderen Größen teils auch über den en der anderen Wells liegen (v gl. Tabelle 10 und Abbildung 17 , rote Säule). Die Standardabweichungen der übr igen Größen befinden sich in einem niedrigen Bereich zwischen 0,87 (nicht – mitochondriale Atmung) und 37 3,52 (Basalatmung). Bis auf die 6,60% des Protonenlecks liegen die Variationskoeffizienten dicht eng beieinander; 2,86% bei der nicht – mitochondrialen Atmun g bis hin zu 3,63% bei der Basalatmung. Die Negativkontrolle verzeichnet im Vergleich zu den stimulierten Zellen bei allen Größen jeweils höhere Standardabweichungen, was sich auch in allen Variationskoeffizienten widerspiegelt. Mit 33,98% liegt hier der W ert der Reserveatmungskapazität am höchsten. Protonenleck und Maximalatmung weisen sehr ähnliche Werte auf (14,88% bzw. 14,50%), während die Variationskoeffizienten der übrigen Größen auf unterschiedlichen Niveaus liegen. Die Werte von Well G für das Proto nenleck, die Maximalatmung und die Reserveatmungskapazität weichen von den Werten der Wells E und F nach oben bzw. nach unten deutlich ab, was auch in der Abbildung 17 zu sehen ist. Abbildung 17 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min 0 50 100 150 200 250 300 350 400 OCR (pmol/min) 4h Stimulation 4h Stimulation 4h Stimulation 4h NTC 4h NTC 4h NTC 38 Abbildung 18 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion Wie in Abbildung 17 ist auch in Abbildung 18 zu sehen, dass die Negativkontrolle höhere Wer te für die Größen der mitochondrialen Atmung aufweist als die stimulierten Zellen. Die prozentuale Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz sind in Tabelle 11 und den Abbildungen 19 und 20 zu sehen. Tabelle 11 : 4h Stim ulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] 4h Stimulation 192,00 81,71 4h Stimulation 226,98 81,34 4h Stimulation 191,54 82,63 4h NTC 184,21 79,93 4h NTC 183,62 79,02 4h NTC 142,79 74,08 Mittelwert 4h Stimulation 203,51 81,89 Standardabweichung 20,33 0,67 Variationskoeffizient 9,99% 0,81% Mittelwert 4h NTC 170,21 77,68 Standardabweichung 23,74 3,15 Variationskoeffizient 13,95% 4,05% 96,92 17,56 197,71 100,79 30,34 79,36 190,02 42,41 323,27 133,25 51,96 147,61 0 50 100 150 200 250 300 350 OCR (pmol/min) 4h Stimulation 4h NTC 39 Die Reserveatmungskapazität beider untersuchten Zellen besitzt höhere Standardabweichungen und Variationskoeffizienten als die Kopplungseffizienz. Wie bei den vorangegangenen Versuchen sind die Werte der Kopplungseffizienz relativ homogen verteilt (s. Abbildun g 19 ). Bei beiden Größen ist zu beobachten, dass Well G geringere Werte aufweist als Well E und F. Abbildung 19 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Abbildung 20 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Im Gegensatz zu den Größen der mitochondrialen Atmung besitzen die stimulierten Zellen eine höhere p rozentuale Reserveatmungskapazität als die nicht – stimulierten Zellen. Auch die Kopplungseffizienz ist zugunsten der stimulierten Zellen erhöht, liegt aber auf einem ähnlichen Niveau wie das der Negativkontrolle. 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 4h Stimulation 4h Stimulation 4h Stimulation 4h NTC 4h NTC 4h NTC 203,51 81,89 170,21 77,68 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 4h Stimulation 4h NTC 40 In Tabelle 12 sind die Werte des Bioenergeti schen Gesundheitsindex zu finden. Tabelle 12 : 4h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 4h Stimulation 1,12 4h Stimulation 1,26 4h Stimulation 1,13 4h NTC 1,09 4h NTC 1,04 4h NTC 0,67 Mittelwert 4h Stimulation 1,17 Standardabweichung 0,08 Variationskoeffizient 6,89% Mittelwert 4h NTC 0,93 Standardabweichung 0,23 Variationskoeffizient 24,70% Der BHI der stimulierten Zellen ist bis auf den leicht erhöhten Wert des Wells C sehr ähnlich. Bei der Negativkontrolle liegt der BHI von Well G deutlich unter dem der anderen Wells, was zu dem hohen Variationskoeffizienten von 24,70% führt. 41 3.1.4. 8h Stimulation Die mitochondriale Atmung der acht Stunden lang stimulierten Zellen und der unstimulierten Kontrolle ist nachfolgend in Abbildung 21 zu sehen. Abbildung 21 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Der OCR der Negativkontrolle weist nur geringfügig niedrigere Werte auf als die stimulierten Zellen. Im Zeitraum zwischen 20 und 35 Minuten (nach Zugabe von Oligomycin) sind innerhalb der stimulierten und der nicht – stimulierten Zellen Differenzen zwi schen den Wells zu erkennen, wobei Well B im Vergleich zu Well C und D stark abfällt und auf einem Niveau mit der Negativkontrolle liegt. Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale AT P – Produktion ergeben sich zu den in Tabelle 13 aufgeführten Werten. In den Abbildungen 22 und 23 sind die Werte graphisch dargestellt. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 8h Stimulation 8h Stimulation 8h Stimulation 8h NTC 8h NTC 8h NTC 42 Tabelle 13 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 8h Stimulation 144,82 21,63 341,01 196,20 44,16 123,19 8h Stimulation 146,61 68,23 345,08 198,46 43,05 78,38 8h Stimulation 152,22 48,24 387,21 234,99 40,49 103,99 8h NTC 138,37 27,43 288,86 150,49 36,08 110,94 8h NTC 122,97 18,54 261,44 138,47 32,62 104,43 8h NTC 127,01 23,21 281,43 154,42 30,79 103,80 Mittelwert 8h Stimulation 147,88 46,03 357,77 209,89 42,56 101,85 Standard – abweichung 3,86 23,38 25,58 21,77 1,88 22,48 Variationsko – effizient 2,61% 50,79% 7,15% 10,37% 4,43% 22,07% Mittelwert 8h NTC 129,45 23,06 277,24 147,79 33,16 106,39 Standard – abweichung 7,98 4,45 14,18 8,31 2,69 3,95 Variationsko – effizient 6,17% 19,29% 5,11% 5,62% 8,11% 3,71% Die Standardabweichungen der stimulierten Zellen für das Protonenleck, die Maximalatmung, die Reserveatmungskapazität und die mitochondriale ATP – Produktion liegen alle über 20. Durch den geringen Mittelwert des Protonenlecks weist dieses mit 50,79% einen sehr hohen Variationskoeffizienten au f . Bedingt wird dies durch die Wells C und D, deren Werte ungefähr dreimal bzw. zweimal so hoch ausfallen wie der Wert des Wells B. Die mitochondriale ATP – Produktion besitzt mit 22,07% den zweithöchsten Variationskoeffizienten. Trotz der höchsten 43 Standardabweichung (25,58) liegt der Variationsk oeffizient der Maximalatmung der allgemein hohen Werte relativ niedrig (7,15%). Bei den unstimulierten Zellen verzeichnet das Protonenleck mit 19,29% den höchsten Variationskoeffizienten, während die Werte der übrigen Größen zwischen 3,71% (mitochondriale ATP – Produktion) und 8,11% (nicht – mitochondriale Atmung) liegen. Abbildung 22 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min In Abbildung 22 ist der Anstieg des OCR von Well C im Messpunkt 4 (s.o.) als rote Säule beim Protonenleck deutlich zu erkennen. Durch das relativ hohe Protonenleck folgt für Well C eine niedrigere mitochondriale ATP – Produktion als bei den Wells B und D; sichtbar an der ro ten Säule in Abbildung 22 . 0 50 100 150 200 250 300 350 400 OCR (pmol/min) 8h Stimulation 8h Stimulation 8h Stimulation 8h NTC 8h NTC 8h NTC 44 Abbildung 23 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion Passend zur mitochondrialen Atmung zeigen die Mittelwerte für den OCR höhere Werte bei den stimulierten als bei den nicht – stimulierten Zellen. Einzig die mitochondriale ATP – Produktion weist ein umgekehrtes Ergebnis auf. Die Tabelle 14 zeigt die Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz, die in den Abbildungen 24 und 25 visualisiert sind. Tabelle 14 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] 8h Stimulation 235,48 85,07 8h Stimulation 235,37 53,46 8h Stimulation 254,37 68,31 8h NTC 208,76 80,17 8h NTC 212,60 84,92 8h NTC 221,58 81,72 Mittelwert 8h Stimulation 241,74 68,95 Standardabweichung 10,94 15,81 Variationskoeffizient 4,53% 22,93% Mittelwert 8h NTC 214,31 82,27 Standardabweichung 6,58 2,42 Variationskoeffizient 3,07% 2,94% 147,88 46,03 357,77 209,89 42,56 101,85 129,45 23,06 277,24 147,79 33,16 106,39 0 50 100 150 200 250 300 350 400 OCR (pmol/min) 8h Stimulation 8h NTC 45 Die stimulierten Zellen weisen im Vergleich zu den nicht – stimulierten Zellen höhere Standardabweichungen auf. Mit Werten von 4,53% und 3,07% befinde t sich die Reserveatmungskapazität beider Zellen auf einem niedrigen Niveau. Für die Kopplungseffizienz schwanken die Werte der Wells B bis D etwas, was sich in der Standardabweichung und dem hohen Variationskoeffizienten von 22,93% niederschlägt. Mit 2,42 bzw. 2,94% fallen die Standardabweichung und der Variationskoeffizient der Kopplungseffizienz der Negativkontrolle am geringsten aus. Abbildung 24 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Abbildung 25 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 8h Stimulation 8h Stimulation 8h Stimulation 8h NTC 8h NTC 8h NTC 241,74 68,95 214,31 82,27 0 100 200 300 400 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 8h Stimulation 8h NTC 46 Die Reserveatmungskapazität der stimulierten Zellen liegt geringfügig höher als die der Negativkontrolle. Bei der Kopplungseffizienz fällt auf, dass die unstimulierten Zellen höhere Werte aufweisen als die stimulierten Zellen. Die Werte des Bioenergetisch en Gesundheitsindex sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Tabelle 15 : 8h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 8h Stimulation 1,40 8h Stimulation 0,72 8h Stimulation 1,10 8h NTC 1,23 8h NTC 1,38 8h NTC 1,35 Mittelwert 8h Stimulation 1,07 Standardabweichung 0,34 Variationskoeffizient 31,65% Mittelwert 8h NTC 1,32 Standardabweichung 0,08 Variationskoeffizient 6,12% Der BHI der nicht – stimulierten Zellen ist mit 1,32 höher als jener der stimulierten Zellen. Der Grund für den auffallend hohen Variationskoeffizienten der stimulierten Zellen von 31,65% liegt in dem geringen Wert des Wells C, der halb so groß ist wie der B HI des Wells B. 47 3.1.5. 24h Stimulation Die 24 Stunden lange Stimulation der THP – 1 – Zellen ergab für die mitochondriale Atmung einen Verlauf, der in Abbildung 26 zu sehen ist. Abbildung 26 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Im Bereich der Maximalatmung lassen sich Unterschiede zwischen den stimulierten und den nicht – stimulierten Zellen erkennen. Diese Differenzen fallen zum Teil jedoch eher gering aus (v gl. Well B und Well E). Auch innerh alb der beiden Gruppen variieren die Werte. Außerdem lässt sich beobachten, dass nach der Zugabe von FCCP der OCR fast aller Wells im Gegensatz zu den vorherigen Versuchen ansteigt. Die aus der m itochondrialen Atmung resultierenden Größen stehen in der Ta belle 16 und sind in den Abbildungen 27 und 28 graphisch aufgetragen. 0 50 100 150 200 250 300 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 24h Stimulation 24h Stimulation 24h Stimulation 24h NTC 24h NTC 24h NTC 48 Tabelle 16 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondri ale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 24h Stimulation 117,20 11,39 211,56 94,36 28,97 105,81 24h Stimulation 125,59 13,19 261,98 136,39 30,59 112,40 24h Stimulation 128,06 14,20 234,62 106,57 29,25 113,86 24h NTC 105,94 12,38 194,64 88,70 26,75 93,55 24h NTC 107,05 10,60 189,77 82,72 27,65 96,45 24h NTC 110,93 12,74 160,01 49,08 19,54 98,19 Mittelwert 24h Stimulation 123,62 12,93 236,06 112,44 29,61 110,69 Standard – abweichung 5,69 1,42 25,24 21,62 0,87 4,29 Variationsko – effizient 4,60% 11,00% 10,69% 19,23% 2,93% 3,87% Mittelwert 24h NTC 107,97 11,91 181,48 73,50 24,65 96,06 Standard – abweichung 2,62 1,15 18,75 21,36 4,44 2,34 Variationsko – effizient 2,43% 9,62% 10,33% 29,06% 18,02% 2,44% Die stimulierten Zellen weisen mit 2,93% bei der nicht – mitochondrialen Atmung den geringsten Variationskoeffizienten auf, der zusammen mit der mitochondrialen ATP – Produktion (3,87%) und der Basalatmung (4,60%) sehr niedrige Werte liefert. Die Standardabwei chung der Reserveatmungskapazität von 21,62 führt zum höchsten Variationskoeffizienten mit 19,23%. Der Grund hierfür findet sich in der Streuung der Werte der drei Wells. Trotz des großen Unterschiedes bei den Standardabweichungen (1,42 bzw. 25,24) liegen die Variationskoeffizienten von 49 Protonenleck und Maximalatmung mit 11,00% bzw. 10.69% dicht beieinander, was durch die generell geringeren Werte des Protonenlecks und die höheren Werte der Maximalatmung bedingt ist. Die unstimulierten Zellen besitzen bei d er Reserveatmungskapazität die höchste Standardabweichung (21,36), die mit dem höchsten Variationskoeffizienten (29,06%) einhergeht. Basalatmung und mitochondriale ATP – Produktion liegen hier mit 2,43% und 2,44% auf einem sehr niedrigen Niveau. Abbildung 27 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min Bei Betrachtung der Abbildung 27 fällt auf, dass Well C (rote Säule) mit Ausnahme des Protonenlecks stets höhere Werte liefert als die Wells B und D. Well G (türkise Säule) liegt bei der Maximalatmung, der Reserveatmungskapazität und der nicht – mitochondrialen Atmung sichtbar unter den We lls E und F, die auch bei den übrigen Größen sehr ähnliche Werte aufweisen. 0 50 100 150 200 250 300 OCR (pmol/min) 24h Stimulation 24h Stimulation 24h Stimulation 24h NTC 24h NTC 24h NTC 50 Abbildung 28 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion Die stimulierten Zellen können in alle n Größen der mitochondrialen Atmung höhere Werte als die nicht – stimulierten Zellen verzeichnen. Bis auf das Protonenleck und die n icht – mitochondriale Atmung ist die Differenz deutlich zu erkennen. Die berechneten Werte der prozentualen Reserveatmungskapazität und der Kopplungseffizienz stehen nachfolgend in Tabelle 17 . Die Abbildungen 29 und 30 zeigen die Daten graphisch. 123,62 12,93 236,06 112,44 29,61 110,69 107,97 11,91 181,48 73,50 24,65 96,06 0 50 100 150 200 250 OCR (pmol/min) 24h Stimulation 24h NTC 51 Tabelle 17 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] 24h Stimulation 180,51 90,28 24h Stimulation 208,60 89,50 24h Stimulation 183,22 88,91 24h NTC 183,73 88,31 24h NTC 177,28 90,10 24h NTC 144,25 88,52 Mittelwert 24h Stimulation 190,77 89,56 Standardabweichung 15,50 0,69 Variationskoeffizient 8,12% 0,77% Mittelwert 24h NTC 168,42 88,97 Standardabweichung 21,18 0,98 Variationskoeffizient 12,58% 1,10% Die Standardabweichungen der Reserveatmungskapazität liegen bei beiden Gruppen im Vergleich zur Kopplungseffizienz höher und führen auch zu den höheren Variationskoeffizienten. Diese sind bei der Kopplungseffizient mit 0,77% bei den stimulierten und 1,10% bei den nicht – stimulierten Zellen äußerst gering, da auch die Standardabweichungen sehr niedrige Werte besitzen (0,69 bzw. 0,98). 52 Abbildung 29 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Die Kopplungseffizienz ist über alle sechs Wells sehr homogen verteilt. Bei der Reserveatmungskapazität weisen Well C (rote Säule) und Well G (türkise Säule) eine Abweichung von den anderen Wells nach oben bzw. nach unten auf. Abbildung 30 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Die Reserveatmungskapazität der stimulierten Zellen nimmt höhere Werte an als die Negativkontrolle. Das gleiche gilt auch für die Kopplungseffizient, wobei der Unterschied äußerst gering ist. In Tabelle 18 finden sich die Werte des Bioenergetischen Gesundheitsindex‘. 0 100 200 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 24h Stimulation 24h Stimulation 24h Stimulation 24h NTC 24h NTC 24h NTC 190,77 89,56 168,42 88,97 0 100 200 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 24h Stimulation 24h NTC 53 Tabelle 18 : 24h Stimulation der THP – 1 – Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 24h Stimulation 1,48 24h Stimulation 1,58 24h Stimulation 1,47 24h NTC 1,40 24h NTC 1,43 24h NTC 1,29 Mittelwert 24h Stimulation 1,51 Standardabweichung 0,06 Variationskoeffizient 4,10% Mittelwert 24h NTC 1,37 Standardabweichung 0,08 Variationskoeffizient 5,62% Der BHI der stimulierten Zellen liegt mit 1,51 höher als jener der nicht – stimulierten Zellen (1,37). Große Schwankungen der Werte der einzelnen Wells sind bei beiden Gruppen nicht zu erkennen, was auch die niedrige Standardabweichungen von 0,06 bzw. 0,08 widerspiegelt. Die Variationskoeffizienten befinden sich mit 4, 10% und 5,62% auf einem eher geringen Niveau. 54 3.1.6. Kinetik der mitochondrialen Atmung In der Abbildung 31 ist die Kinetik der mitochondrialen Atmung der stimulierten THP – 1 – Zellen zu sehen. Aufgetragen ist der OCR in pmol O 2 /min gegen die Zeit in Stunden. Abbildung 31 : Entwicklung der mitochondrialen Atmung der stimulierten THP – 1 – Zellen in pmol O 2 /min Für alle Parameter ist nach einer Stunde Stimulation im Vergleich zum Vorversuch (0h) ein Anstieg des OCR zu erkennen. Dieser fällt nach vier Stunden wieder ab und steigt nach acht Stunden wieder etwas an. Basalatmung und Protonenleck besitzen im Gegensatz zu den anderen Gr ößen nach acht Stunden höhere Werte als nach vier Stunden Stimulation. Nach 24 Stunden sinkt der OCR durchgehend wieder; nur die mitochondriale ATP – Produktion steigt etwas an. Die größten Schwankungen treten bei der Maximalatmung und der Reserveatmungskapa zität auf. Die Entwicklung für die mitochondriale Atmung der nicht – stimulierten THP – 1 – Zellen ist in d er folgenden Abbildung zu sehen. 0 100 200 300 400 500 600 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 OCR [pmol/min] Zeit [h] Basalatmung Protonenleck Maximalatmung Reserveatmungskapazität nicht-mitochondriale Atmung mitochondriale ATP-Produktion 55 Abbildung 32 : Entwicklung der mitochondrialen Atmung der nicht – stimulierten THP – 1 – Zellen i n pmol O 2 /min Alle Größen der mitochondrialen Atmung steigen im Laufe der Zeit bis vier Stunden an und fallen bis auf die Reserveatmungskapazität danach wieder ab. -50 50 150 250 350 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 OCR [pmol/min] Zeit [h] Basalatmung Protonenleck Maximalatmung Reserveatmungskapazität nicht-mitochondriale Atmung mitochondriale ATP-Produktion 56 3.2. PMA – differenzierte Zellen 3.2.1. Vorversuch Als Vorbetrachtung für nachfolgende Versuche wurden THP – 1 – Zellen der Passage 19 genutzt, bei denen mittels PMA eine Ausdifferenzierung zu Makrophagen vor genommen wurde . Durch den Test im Seahorse wurde ein Bild des Ist – Zustandes der Zellen aufgenommen. Die mitochondriale Atmung der PMA – differenzierten Zellen ist in der folgenden Abbildung 33 zu sehen. Abbildung 33 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Für die Sechsfachbestimmung ergeben sich ähnliche Verläufe, die nach FCCP – Zugabe die größten Inhomogenitäten aufweisen. Für die Basalatmung, das Protonenleck, die Maximalatmung, die Reserveatmungskapazität, die nicht – mitochondriale Atmung und die mitochond riale ATP – Produktion stehen die berechneten Werte in Tabelle 19 und sind mit den Mittelwerten und Standardabweichungen in den Abbildungen 34 und 35 abgebildet. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen 57 Tabelle 19 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Basalatmun g (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] Well B 20,39 1,56 41,18 20,79 15,65 18,83 Well C 24,02 3,52 47,50 23,47 15,62 20,50 Well D 21,03 – 0,32 37,83 16,80 15,91 18,63 Well E 27,18 – 2,40 36,61 9,43 15,54 22,56 Well F 22,23 3,98 33,37 11,14 13,90 18,25 Well G 21,60 4,39 32,92 11,32 13,70 17,21 Mittelwert 22,74 1,79 38,23 15,49 15,05 19,33 Standard – abweichung 2,50 2,71 5,46 5,77 0,98 1,91 Variationsko – effizient 11,01% 151,21% 14,29% 37,25% 6,52% 9,88% Die Standardabweichungen aller Größen bewegen sich in einem Bereich zwischen 0,98 (nicht – mitochondriale Atmung) und 5,77 (Reserveatmungskapazität). Hingegen variieren die Variationskoeffizienten stark. Mit 151,21% liefert das Protonenleck hier ein en Ausreißer, der keinen realen Wert widerspiegelt. Grund sind die negativen Werte der Wells D und E, die trotzdem in die Berechnung mit eingeflossen sind. Den geringsten Variationskoeffizienten besitzt die nicht – mitochondriale Atmung (6,52%). Mitochondriale ATP – Produktion, Basalatmung und Maximalatmung liegen auf ein em ähnlichen Niveau. Die Reserveatmungskapazität hat abgesehen vom Protonenleck mit 37,25% den höchsten Variationskoeffizienten, was an der Streuung der Werte liegt. 58 Abbildung 34 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Ba salatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min Abbildung 35 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion Rechnerisch ergeben sich die prozentuale Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz z u den in Tabelle 20 und den in Abbildung 36 und 37 dargestellten Werten. 0 20 40 60 80 100 OCR (pmol/min) PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen 22,74 1,79 38,23 15,49 15,05 19,33 0 50 100 150 OCR (pmol/min) PMA Zellen 59 Tabelle 20 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] Well B 201,95 92,35 Well C 197,71 85,34 Well D 179,92 88,60 Well E 134,71 83,01 Well F 150,11 82,12 Well G 152,41 79,65 Mittelwert 169,47 85,18 Standardabweichung 27,70 4,64 Variationskoeffizient 16,34% 5,45% Bei der Reserveatmungskapazität variieren die Werte im Bereich zwischen 134,71 (Well E) und 201,95 (Well B), was zu einer Standardabweichung von 27,70 und einem Variationskoeffizienten von 16,34% führt, die beide höher liegen als die der Kopplungseffizienz . Abbildung 36 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % 0 100 200 300 400 Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen PMA Zellen 60 Abbildung 37 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Der Bioenergetische Gesundheitsindex der PMA – differenzierten Zellen ist nachfolgend in Tabelle 21 zu finden. Tabelle 21 : Vorversuch mit PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI Well B 1,21 Well C 0,94 Well D 1,29 Well E 1,14 Well F 0,57 Well G 0,51 Mittelwert 0,94 Standardabweichung 0,33 Variationskoeffizient 35,49% Die einzelnen BHI der Wells unterscheiden sich zum Teil deutlich, was dazu führt, dass der Variationskoeffizient mit 35,49% hoch ausfällt. 169,47 85,18 0 100 200 300 400 Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) PMA Zellen 61 3.2.2. 1h Stimulation Für die eine Stunde mit dem Magnetstreifen bzw. dem Mock – Magnetstreifen stimulierten PMA – differenzierten Zellen erg ab sich nach der Untersuchung im Seahorse der folgende Verlauf der mitochondrialen Atmung: Abbildung 38 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Die mitgeführte Negativkontrolle weist in der Dreifachbestimmung sehr homogene Verläufe auf, während bei den stimulierten Zellen einige Abweichungen untereinander zu erkennen sind. Nach der Zugabe von Rotenone/Antimycin A fällt bei diesen der OCR langsam und kontinuierlich. Deutlich sicht bar sind die höheren Werte des OCR bei den stimulierten Zellen im Vergleic h zu den unstimulierten Zellen. Die sich aus der m itochondrialen Atmung ergebenden weiteren Größen sind mit den Mittelwerten und den Standardabweichungen der zusammengefassten stimulierten und unstimulierten Zellen in der Tabelle 22 und den Abbildungen 39 und 40 zu sehen. 0 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 1h Stimulation 1h Stimulation 1h Stimulation 1h NTC 1h NTC 1h NTC 62 Tabelle 22 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 1h Stimulation 64,05 – 45,60 549,16 485,11 108,07 109,65 1h Stimulation 58,54 – 39,84 478,82 420,28 92,99 98,38 1h Stimulation 107,55 – 9,14 563,95 456,40 77,35 116,69 1h NTC 51,60 – 1,69 273,11 221,51 37,36 53,29 1h NTC 45,42 – 0,82 217,42 172,00 32,55 46,24 1h NTC 48,16 – 0,05 239,54 191,38 31,15 48,21 Mittelwert 1h Stimulation 76,71 – 31,53 530,64 453,93 92,80 108,24 Standard – abweichung 26,85 19,60 45,49 32,48 15,36 9,24 Variationsko – effizient 35,00% – 62,17% 8,57% 7,16% 16,55% 8,53% Mittelwert 1h NTC 48,39 – 0,85 243,36 194,96 33,69 49,25 Standard – abweichung 3,10 0,82 28,04 24,95 3,26 3,64 Variationsko – effizient 6,40% – 96,00% 11,52% 12,80% 9,67% 7,39% Bei der Betrachtung der Tabelle fällt als erstes auf, dass alle Wells beim Protonenleck negative Werte besitzen. Dementsprechend sind die rechnerischen Mittelwerte und Variationskoeffizienten auch negativ. Reale Zustände werden somit nicht widerges piegelt. Die Standardabweichungen der stimulierten Zellen liegen bis auf eine Ausnahme alle über 15, was in der Streuung der Werte aller Wells begründet liegt. Die Variationskoeffizienten der Reserveatmungskapazität, der mitochondrialen ATP – Produktion und der Maximalatmung nehmen Werte unter 10% 63 an, während die Basalatmung mit 35,00% den höchsten Wert besitzt. Die nicht – stimulierten Zellen weisen für jede Größe geringe Standardabweichungen auf. Alle Variationskoeffizienten, außer der des Protonenlecks, lieg en nicht sehr weit auseinander und bewegen sich zwischen 6,40% (Basalatmung) und 12,80% (Reserveatmungskapazität). Abbildung 39 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min In Abbildung 39 ist zu sehen, dass bei der Basalatmung Well D (grüne Säule) deutlich von den anderen Wells abweicht. Bei der Maximalatmung und der Reserv eatmungskapazität ist der Unterschied zwischen den Wells innerhalb einer Gruppe gut sichtbar. Die Werte der Negativkontrolle bei der Basalatmung, der nicht – mitochondrialen Atmung und der mitochondrialen ATP – Produktion weichen nur geringfügig voneinander ab . 0 100 200 300 400 500 600 OCR (pmol/min) 1h Stimulation 1h Stimulation 1h Stimulation 1h NTC 1h NTC 1h NTC 64 Abbildung 40 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion Die stimulierten Zellen weisen durchgehend höhere Werte aller Größen als die unstimulierten Zellen auf. Außer bei der Basalatmung sind diese Werte teils mehr als doppelt so hoch. Die Reserveatmungskapazität und die Kopplungse ffizienz in Prozent sind tabellarisch und graphisch im Folgenden aufgetragen: Tabelle 23 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] 1h Stimulation 857,38 171,20 1h Stimulation 817,96 168,06 1h Stimulation 524,36 108,50 1h NTC 529,24 103,27 1h NTC 478,69 101,81 1h NTC 497,41 100,10 Mittelwert 1h Stimulation 733,23 149,25 Standardabweichung 181,96 35,33 Variationskoeffizient 24,82% 23,67% Mittelwert 1h NTC 501,78 101,73 Standardabweichung 25,56 1,58 Variationskoeffizient 5,09% 1,56% 76,71 530,64 453,93 92,80 108,24 48,39 243,36 194,96 33,69 49,25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 OCR (pmol/min) 1h Stimulation 1h NTC 65 Die Standardabweichungen der stimulierten Zellen sind größer als die der Negativkontrolle, ebenso die Variationskoeffizienten. Diese liegen mit 24,82% und 23,67% bei den stimulierten Zellen dicht beieinander. Die Variationskoeffizienten der unstimulierten Zellen sind deutlich niedriger und zeigen eine eher geringe Schwankung der Werte. Abbildung 41 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Auffällig bei der Betrachtung der Abbildung 41 sind die vergleichsweise hohen Werte der Reserveatmungskapazität und der Kopplungseffizienz der Wells B und C (orange und rote Säule). Well D liegt bei beiden Größen auf einem Niveau mit den Wells E bis G. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 1h Stimulation 1h Stimulation 1h Stimulation 1h NTC 1h NTC 1h NTC 66 Abbildung 42 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Sowohl Reserveatmungskapazität als auch Kopplungseffizienz liefern für die stimulierten Zellen höherer Werte als die Negativkontrolle. In der Tabelle 24 steht der B ioenergetische Gesundheitsindex der stimulierten und unstimulierten PMA – differenzierten Zellen. Tabelle 24 : 1h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 1h Stimulation 2,69 1h Stimulation 2,65 1h Stimulation 2,84 1h NTC 2,50 1h NTC 2,39 1h NTC 2,47 Mittelwert 1h Stimulation 2,73 Standardabweichung 0,10 Variationskoeffizient 3,65% Mittelwert 1h NTC 2,45 Standardabweichung 0,06 Variationskoeffizient 2,37% 733,23 149,25 501,78 101,73 0 100 200 300 400 500 600 700 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 1h Stimulation 1h NTC 67 Der BHI der nicht – stimulierten Zellen liegt mit 2,45 etwas unter dem BHI der stimulierten Zellen (2,73). Die relativ ähnlichen Werte innerhalb einer Gruppe führen zu den geringen Standardabweichungen und den niedrigen Varationskoeffizienten. 3.2.3. 4h Stimulation Die PMA – differenzierten Zellen, die dem Magnetstreifen bzw. dem Mock – Magnetstreifen für vier Stunden ausgesetzt waren, wiesen folgenden Verlauf der mitochondrialen Atmung auf: Abbildung 43 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Sowohl stimulierte als auch nicht – stimulierte Zellen besitzen untereinander ähnliche Werte, wobei der OCR der stimulierten Zellen nach FCCP – Zugabe um ungefähr 200 pmol/min höher liegt als jener der Negativkontrolle. In Tabelle 25 sind die aus der m itochondrialen Atmung resultierenden Größen gesammelt. 0 50 100 150 200 250 300 350 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 4h Stimulation 4h Stimulation 4h NTC 4h NTC 68 Tabelle 25 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min] PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 4h Stimulation 38,79 – 5,57 259,02 220,23 39,97 44,36 4h Stimulation 45,96 – 2,87 289,91 243,95 39,51 48,83 4h NTC 28,63 – 3,87 173,20 144,56 29,19 32,50 4h NTC 28,07 – 3,47 153,38 125,32 26,93 31,53 Mittelwert 4h Stimulation 42,37 – 4,22 274,47 232,09 39,74 46,59 Standard – abweichung 5,07 1,91 21,84 16,77 0,33 3,16 Variationsko – effizient 11,97% – 45,27% 7,96% 7,23% 0,83% 6,78% Mittelwert 4h NTC 28,35 – 3,67 163,29 134,94 28,06 32,02 Standard – abweichung 0,40 0,28 14,01 13,61 1,60 0,69 Variationsko – effizient 1,42% – 7,70% 8,58% 10,09% 5,70% 2,14% Wie zuvor bei der einstündigen Stimulation der PMA – Zellen ist auch hier zu sehen, dass das Protonenleck aller Wells durchgehend negative Werte annimmt. Den geringsten Variationskoeffizienten v erzeichnen die stimulierten Zellen bei der nicht – mitochondrialen Atmung (0,83%). Mit 11,97% weist die Basalatmung den höchsten Wert auf. Mitochondriale ATP – Produktion, Reserveatmungskapazität und Maximalatmung bewegen sich im Bereich zwischen 6,78% und 7,9 6%. Mit Ausnahme der nicht – mitochondrialen Atmung liefern die unstimulierten Zellen niedrigere Werte für die Standardabweichungen. Im Gegensatz zur anderen Gruppe besitzt hier die Basalatmung den geringsten Variationskoeffizient (1,42%). Die Reserveatmungs kapazität stellt mit 10,09% den höchsten Wert dar. 69 Die Abbildungen 44 und 45 stellen die Werte aus Tabelle 25 graphisch dar. Abbildung 44 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min Bis auf die nicht – mitochondriale Atmung besitzt Well C (blaue Säule) höhere Werte als Well B (grüne Säule). Well D und E befinden sich auß er bei der Maximalatmung und der Reserveatmungskapazität auf einem sehr ähnlichen Niveau. Abbildung 45 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Proton enleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion 0 50 100 150 200 250 300 OCR (pmol/min) 4h Stimulation 4h Stimulation 4h NTC 4h NTC 42,37 274,47 232,09 39,74 46,59 28,35 163,29 134,94 28,06 32,02 0 50 100 150 200 250 300 OCR (pmol/min) 4h Stimulation 4h NTC 70 Die nicht – stimulierten Zellen verzeichnen bei allen Größen der mitochondrialen Atmung niedrigere Werte als die stimulierten Zellen. Am Deutlichst en fällt dies bei der Maximalatmung und der Reserveatmungskapazität auf. In der Tabelle 26 sowie in den Abbildungen 46 und 47 sind die prozentuale Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz zu finden. Tabelle 26 : 4h Stim ulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] 4h Stimulation 667,81 114,36 4h Stimulation 630,82 106,24 4h NTC 604,85 113,51 4h NTC 546,52 112,36 Mittelwert 4h Stimulation 649,32 110,30 Standardabweichung 26,16 5,74 Variationskoeffizient 4,03% 5,21% Mittelwert 4h NTC 575,69 112,93 Standardabweichung 41,25 0,81 Variationskoeffizient 7,17% 0,72% Die Werte der Variationskoeffizienten beider Gruppen liegen sowohl für die Reserveatmungskapazität als auch für die Kopplungseffizienz auf einem niedrigen Niveau und bewegen sich in einem Bereich zwischen 0,81% (Kopplungseffizienz unstimulierte Zellen) und 7,17% ( Reserveatmungskapazität unstimulierte Zellen). 71 Abbildung 46 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Abbildung 47 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Die Reserveatmungskapazität fällt bei den stimulierten Zellen etwas höher aus, wohingegen die nicht – stimulierten Zel len eine leicht höhere Kopplungseffizienz verzeichnen. Der Bioenergetische Gesundheitsindex ergibt sich für die untersuchten Zellen zu den in Tabelle 27 stehenden Werten. 0 100 200 300 400 500 600 700 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 4h Stimulation 4h Stimulation 4h NTC 4h NTC 649,32 110,30 575,69 112,93 0 100 200 300 400 500 600 700 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 4h Stimulation 4h NTC 72 Tabelle 27 : 4h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 4h Stimulation 2,39 4h Stimulation 2,48 4h NTC 2,21 4h NTC 2,17 Mittelwert 4h Stimulation 2,43 Standardabweichung 0,06 Variationskoeffizient 2,65% Mittelwert 4h NTC 2,19 Standardabweichung 0,03 Variationskoeffizient 1,30% Stimulierte und unstimulierte Zellen besitzen niedrige Standardabweichungen (0,06 bzw. 0,03), die zu niedrigen Variationskoeffizienten führen (2,65% bzw. 1,30%). Der BHI der Negativkontrolle fällt dabei etwas geringer aus als der BHI der stimulierten Zellen. 73 3.2.4. 24h Stimulation Der Verlauf der mitochondrialen Atmung der 24 Stunden stimulierten und nicht – stimulierten PMA – differenzierten Zellen ist in der folgenden Abbildung zu sehen: Abbildung 48 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mitochondriale Atmung in pmol O 2 /min Die Dreifachbestimmungen der stimulierten und nicht – stimulierten Zellen sind jeweils homogen. Sie weisen Unterschiede dahingehen d auf, dass die Negativkontrolle erhöhte Werte, vor allem im Bereich der Maximalatmung , besitzt. Die Tabelle 28 zeigt Basalatmung, Protonenleck, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion der PMA – Zellen mit den entsprechenden Mittelwerten und Standardabweichungen. 0 100 200 300 400 500 600 0 10 20 30 40 50 60 70 80 OCR (pmol/min) Zeit [min] 24h Stimulation 24h Stimulation 24h Stimulation 24h NTC 24h NTC 24h NTC 74 Tabelle 28 : 24h Stimula tion der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung (BA), Protonenleck (PL), Maximalatmung (MA), Reserveatmungskapazität (RAK), nicht – mitochondriale Atmung (nmA) und mitochondriale ATP – Produktion (mATP) in pmol O 2 /min BA [pmol O 2 /min]g PL [pmol O 2 /min] MA [pmol O 2 /min] RAK [pmol O 2 /min] nmA [pmol O 2 /min] mATP [pmol O 2 /min] 24h Stimulation 55,10 1,77 287,57 232,48 33,30 53,33 24h Stimulation 50,43 – 0,81 277,47 227,04 31,70 51,23 24h Stimulation 64,83 1,12 332,92 268,09 34,59 63,71 24h NTC 112,13 9,96 559,62 447,49 46,54 102,17 24h NTC 96,11 8,49 507,72 411,61 39,88 87,62 24h NTC 100,17 6,80 541,59 441,42 41,33 93,36 Mittelwert 24h Stimulation 56,78 0,69 299,32 242,54 33,20 56,09 Standard – abweichung 7,35 1,34 29,53 22,30 1,45 6,68 Variationsko – effizient 12,94% 193,01% 9,87% 9,19% 4,36% 11,91% Mittelwert 24h NTC 102,80 8,42 536,31 433,51 42,59 94,38 Standard – abweichung 8,33 1,58 26,35 19,21 3,50 7,33 Variationsko – effizient 8,10% 18,77% 4,91% 4,43% 8,23% 7,76% Aufgrund des negativen Protonenlecks in Well C (stimulierte Zellen) ergibt sich ein nicht aussagekräftiger Mittelwert, der mit einer geringen Standardabweichung zu einem unrealen Variationskoeffizienten von 193,01% führt. Davon abgesehen besitzt die Basalatmung mit 12, 94% den höchsten Wert der stimulierten Zellen , gefolgt von der mitochondrialen ATP – Produktion mit 11,91%. Maximalatmung und Reserveatmung skapazität weisen ähnliche Werte auf (9,87% bzw. 9,19%), während die nicht – mitochondriale Atmung mit 4,36% den geringst en Variationskoeffizienten 75 verzeichnet. Bei den nicht – stimulierten Zellen findet sich di e ser mit 4,43% bei der Reserveatmungskapazität. Mitochondriale ATP – Produktion, Basalatmung und nicht – mitochondriale Atmung bewegen sich in einem Bereich zwischen 7,76% und 8,23%. In den Abbildungen 49 und 50 sind die Werte aus Tabelle 25 graphisch aufgetragen. Abbildung 49 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondriale ATP – Produktion in pmol O 2 /min Im Vergleich zu Well B und C liefert Well D bei fast allen Größen die höchsten Werte der stimulierten Zellen. Well E verzeichnet bei der Negativkontrolle die höchsten Werte. Abbildung 50 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert (in pmol O 2 /min) und Standardabweichung für Basalatmung, Protonenleck, Maximalatmung, Reserveatmungskapazität, nicht – mitochondriale Atmung und mitochondria le ATP – Produktion 0 100 200 300 400 500 600 OCR (pmol/min) 24h Stimulation 24h Stimulation 24h Stimulation 24h NTC 24h NTC 24h NTC 56,78 0,69 299,32 242,54 33,20 56,09 102,80 8,42 536,31 433,51 42,59 94,38 0 100 200 300 400 500 OCR (pmol/min) 24h Stimulation 24h NTC 76 Entsprechend des Verlaufes der mitochondrialen Atmung ergeben sich für die unstimulierten Zellen überall höhere Werte als für die stimulierten Zellen. Die prozentuale Reserveatmungskapazität und die Kopplungseffizienz sind in der Tabelle 29 und den Abbildungen 51 und 52 dargestellt. Tabelle 29 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Reserveatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] 24h Stimulation 521,94 96,78 24h Stimulation 550,25 101,60 24h Stimulation 513,52 98,27 24h NTC 499,09 91,12 24h NTC 528,26 91,17 24h NTC 540,70 93,21 Mittelwert 24h Stimulation 528,57 98,89 Standardabweichung 19,24 2,47 Variationskoeffizient 3,64% 2,49% Mittelwert 24h NTC 522,68 91,83 Standardabweichung 21,36 1,19 Variationskoeffizient 4,09% 1,30% Die Variationskoeffizienten der nicht – stimulierten Zellen fallen für die Kopplungseffizienz am niedrigsten (1,30%) und für die Reserveatmungskapazität am höchsten (4,09%) aus. Die Werte der stimulierten Zellen liegen in diesem Intervall. Auffällig sind die Standardabweichungen der Kopplungseffizienz, die geringer sind als die der Reserveatmungskapazität . 77 Abbildung 51 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Die Kopplungseffizienz ist sehr homogen verteil t , während bei der Reserveatmungskapazität leichte Differenzen innerhalb jeder Gruppe zu sehen sind. Ab bildung 52 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Mittelwert und Standardabweichung für Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz in % Sowohl die Reserveatmungskapazität als auch die Kopplungseffizienz sind für stimulierte und unstimulierte Zellen annähernd gleich, wobei die stimulierten Zellen nur marginal höhere Werte aufweisen. Nachfolgend stehen in der Tabelle 30 die Werte des Bioenergetischen Gesundheitsindex‘. 0 100 200 300 400 500 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 24h Stimulation 24h Stimulation 24h Stimulation 24h NTC 24h NTC 24h NTC 528,57 98,89 522,68 91,83 0 100 200 300 400 500 Restatmungskapazität [%] Kopplungseffizienz [%] OCR (%) 24h Stimulation 24h NTC 78 Tabe lle 30 : 24h Stimulation der PMA – differenzierten Zellen: Bioenergetischer Gesundheitsindex (BHI) BHI 24h Stimulation 2,32 24h Stimulation 2,56 24h Stimulation 2,64 24h NTC 1,99 24h NTC 2,03 24h NTC 2,17 Mittelwert 24h Stimulation 2,51 Standardabweichung 0,17 Variationskoeffizient 6,68% Mittelwert 24h NTC 2,06 Standardabweichung 0,09 Variationskoeffizient 4,42% Der BHI der stimulierten Zellen beträgt 2,51 und liegt somit höher als der BHI der nicht – stimulierten Zellen (2,06). Durch die leichte Streuung der Werte der Wells B bis D ergibt sich ein Variationskoeffizient von 6,68%, der größer ist als de r der Negativkontrolle (4,42%). 79 4. Diskussion 4.1. Auswertung der THP – 1 – Suspensionsz ellen Als Grundlage zur Beurteilung eines möglichen Einflusses der Kleinschen Felder auf den Metabolismus von THP – 1 – Zellen über verschiedene Zeiten bietet sich zunächst eine Betrachtung der Entwicklung der mitochondrialen Atmung der „unbehandelten “ , also nicht – s timulierten Zellen an. D ie nicht – mitochondriale Atmung, das Protonenleck, die Basalatmung, die mitochondriale ATP – Produktion und die Maximalatmung sowie die Reserveatmungskapazität der unstimulierten Zellen verzeichnen einen Anstieg bis zu einem Zeitpunkt von vier Stunden. Da THP – 1 – Zellen Tumorzellen sind, die stark proliferieren, gehen die erhöhten Werte der Parameter der mitochondrialen Atmung auf ein Wachstum der Zellen zurück. Nach vier Stunden sinken diese Werte mit Ausnahme der Reserveatmungskapazität etwas und zeigen im Bereich zwischen acht und 24 Stunden bis auf die Maximalatmung nur noch geringfügige Änderungen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass hier eine Wachstumskinetik beobachtet wurde und die THP – 1 – Zellen nach etwa vier Stunden von eine r Wachstums – in eine stationäre Phase übergehen. Die mit den Magnetstreifen stimulierten Zellen zeigen eine Entwicklung der mitochondrialen Atmung, die sich in Teilen von der der nicht – stimulierten Zellen unterscheidet (vgl. Abbildungen 31 und 32 ). In der ersten Stunde steigen alle Größen an, wobei die Maximalatmung und die Reserveatmungskapazität den größten Anstieg besitzen. Im Vergleich zu den unstimulierten Zellen führt die Stimulation der Zellen zu deutlich erhöhten Werten: die Maximalatmung beträgt n ach einer Stunde mit einem OCR von 500,06 pmol O 2 /min das 3,3fache, während die Reserveatmungskapazität auf das 5,5fache (360,99 pmol O 2 /min) ansteigt (vgl. Tabelle 7 ). Nach einer Stunde fallen alle Größen der mitochondrialen Atmung wieder ab und erreichen zum Zeitpunkt von vier Stunden Werte, die alle unter denen der nicht – stimulierten Zellen nach vier Stunden liegen (vgl. Tabelle 10 ). Im Verlauf bis acht Stunden stei gen die nicht – mitochondriale Atmung, das Protonenleck, die Basalatmung, die mitochondriale ATP – Produktion und die Maximalatmung sowie die Reserveatmungskapazität wieder an. Verglichen mit den unstimulierten Zellen sind 80 die Werte bei acht Stunden mit Ausnah me der mitochondrialen ATP – Produktion etwas höher (vgl. Tabelle 13 ). Die prozentuale Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz der nicht – stimulierten THP – 1 – Zellen schwanken über den untersuchten Zeitraum von 24 Stunden. Während des Wachstums der Zell en in den ersten vier Stunden fällt die Reserveatmungskapazität von 213,34% auf 170,21% (vgl. Tabellen 5 und 11 ), bevor sie bei acht Stunden das Ausgangsniveau wieder erreicht (214,31%; vgl. Tabelle 14 ) und sich nach 24 Stunden mit 168,42% ungefähr dem Wer t nach vier Stunden angleicht (vgl. Tabellen 11 und 17 ). Der Trend der Kopplungseffizienz ist bis vier Stunden ähnlich und fällt ebenfalls ab (vgl. Tabellen 5 , 8 und 11 ). Bis 24 Stunden steigen die Werte jedoch wieder und liegen dann mit 88,97% fast beim A usgangwert von 89,86% (vgl. Tabellen 5 und 17 ). Die stimulierten THP – 1 – Zellen weisen bei der Reserveatmungskapazität Werte auf, die im Gegensatz zu den unstimulierten Zellen nach einer Stunde angestiegen sind (vgl. Tabelle 8 ). Nach den vier Stunden folgen sie jedoch dem Schema der nicht – stimulierten Zellen und steigen bei acht Stunden an, bevor sie nach 24 Stunden wieder abfallen. Mit 190,77% liegen die stimulierten Zellen nur leicht höher als die unstimulierten Zellen und somit näher am Ausgangswert von 2 13,34% (vgl. Tabellen 5 und 17 ). Die Kopplungseffizient sinkt nach Beginn der Stimulation der Zellen zunächst im Zeitraum bis acht Stunden (vgl. Tabellen 5 , 8 , 11 und 14 ), ehe mit 89,56% nach 24 Stunden ein Wert erreicht wird, der nahe beim Ausgangsniveau liegt (89,86; vgl. Tabellen 5 und 17 ). Der Bioenergetische Gesundheitsindex (BHI) der nicht – stimulierten Zellen korreliert mit der Wachstumskinetik dahingehend, dass während des Wachstums der Zellen, bei dem die Parameter der mitochondrialen Atmung steige n, der BHI von 1,21 auf 0,93 sinkt (vgl. Tabellen 6 und 12 ) und dieser nach Beginn der stationären Phase im Gegensatz zur sinkenden mitochondrialen Atmung ansteigt und mit 1,37 nach 24 Stunden einen höheren Wert erreicht als zu Beginn (vgl. Tabelle 18 ). Die Erklärung für dieses Phänomen liegt in der Berechnungsgrundlage des BHI und der Entwicklung der beteiligten Parameter im Laufe der Untersuchung. Ein geringerer BHI geht zum Beispiel mit einem kleineren Quotienten im dekadischen Logarithmus 81 einher. I m Bereich zwischen null und einer Stunde erhöhen sich die im Zähler stehenden Werte der Reserveatmungskapazität und der mitochondrialen ATP – Produktion insgesamt um den Faktor 2,8, während die im Nenner befindlichen Werte des Protonenlecks und der nicht – mit ochondrialen Atmung um den Faktor 3,2 steigen. Dies führt zu einem 8%ig geringerem BHI nach einer Stunde als zu Beginn. Im Zeitraum von einer bis vier Stunden verändern sich die Werte im Zähler um den Faktor 4 und im Nenner um den Faktor 6,2. Der BHI fällt nach vier Stunden um weitere 16%. Ein Vergleich der Tabellen 4 und 7 zeigt auf, dass gegen Ende der Wachstumsphase (zwischen einer und vier Stunden) Reserveatmungskapazität, mitochondriale ATP – Produktion und nicht – mitochondriale Atmung um das Doppelte ans teigen; das Protonenleck sogar um das Dreifache. Der Anstieg des BHI nach acht Stunden auf 1,32 (vgl. Tabelle 15 ) lässt sich darauf zurückführen, dass die Reserveatmungskapazität im Gegensatz zu Protonenleck, nicht – mitochondrialer Atmung und mitochondriale r ATP – Produktion, die wieder sinken, noch weiter ansteigt. Die stimulierten Zellen verzeichnen nach einer Stunde einen BHI von 1,58 (vgl. Tabelle 9 ), dessen Steigerung im Vergleich zum Startwert auf dem starken Anstieg der Maximalatmung und der mitochondr ialen ATP – Produktion und der daraus resultierenden Reserveatmungskapazität beruht (vgl. Tabelle 4 und 7 ). Da im Zeitraum bis vier Stunden das Protonenleck und die nicht – mitochondriale Atmung nur geringfügig gesunken sind, die Reserveatmungskapazität jedoch stark eingebrochen ist und in etwa auf dem Niveau der mitochondrialen ATP – Produktion liegt, verringert sich der BHI um 26% auf 1,17 (vgl. Tabelle 12 ). Im weiteren Verlauf bis acht Stunden fällt der BHI weiter ab, bevor er aufgrund der weiterhin ansteigend en mitochondrialen ATP – Produktion einen Wert von 1,51 erreicht (vgl. Tabelle 18 ). Hierzu trägt auch der Umstand bei, dass das Protonenleck und die nicht – mitochondriale Atmung wieder sinken und sich ihrem Anfangsniveau annähern (vgl. Tabelle 4 und 17 ). 82 4.2. Auswertung der PMA – differenzierten THP – 1 – Zellen Anders als bei den THP – 1 – Zellen lässt sich für die PMA – differenzierten Zellen keine Kinetik der mitochondrialen Atmung als Vorbetrachtung nutzen. Die Suspensionskultur der THP – 1 – Zellen erfuhr durch wöchentl iche Passagierung und Fütterung ein kontinuierliches Wachstum. Im Gegensatz dazu wurden THP – 1 – Zellen zur Ausdifferenzierung mit PMA unregelmäßig und nur in Vorbereitung einer anstehenden Stimulation angesetzt. Da ihr Wachstum abgeschlossen ist, sobald sie vollständig zu makrophagenähnlichen Zellen differenziert sind, beträgt ihre Lebenszeit nur wenige Tage. Verschiedene Ausprägungen der mitochondrialen Atmung zu unterschiedlichen Zeitpunkten lassen sich bei den PMA – differenzierten Zellen daher nur beding t i n einen Zusammenhang setzen. Lediglich ein Vergleich der stimulierten und nicht – stimulierten Zellen zu jedem Zeitpunkt kann erfolgen. Einstündig stimulierte PMA – differenzierte Zellen weisen im Vergleich zu nicht – stimulierten Zellen durchgehend höhere Wert e des OCR auf (vgl. Abbildung 38 ). Auffällig ist der große Unterschied bei der Maximalatmung und der Reserveatmungskapazität, der 287,28 pmol O 2 /min bzw. 258,97 pmol O 2 /min beträgt. Das Protonenleck nimmt bei allen Zellen negative Werte an, die keinen real en Zustand widerspiegeln, da dies bedeuten würde, dass Protonen trotz des sich nicht auflösenden Gradienten im perimitochondrialen Spalt nach der Zugabe von Oligomycin durch die Cytochromkette diffundieren. Erklären ließ sich dieses Phänomen mit einer zu g eringen Konzentration des Oligomycins, sodass vereinzelt Protonen durch die ATP – Synthase in die Matrix gelangen und deshalb weiter Protonen in den Intermembranraum diffundieren, um den Gradienten aufrecht zu erhalten. Die ATP – Produktion der stimulierten PM A – Zellen liegt doppelt so hoch wie bei den Zellen ohne Stimulation. Die größte Steigerung erfährt die nicht – mitochondriale Atmung, die auf das 2,8fache ansteigt (vgl. Tabelle 22 ). Die prozentuale Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz der stimulier ten Zellen nehmen die 1,5fachen Werte der nicht – stimulierten Zellen an (vgl. Tabelle 23 und Abbildung 42 ). Aufgrund der höher liegenden Werte der Parameter der mitochondrialen Atmung besitzen die stimulierten PMA – Zellen den höheren BHI; das Protonenleck wir d hierbei zur Berechnung des BHI für alle negativen Werte auf eins gesetzt (vgl. Tabelle 24 ) . 83 Werden PMA – differenzierte Zellen vier Stunden lang stimuliert , so verzeichnen sie eine höhere mitochondriale Atmung als nicht – stimulierte Zellen (vgl. Abbildu ng 43 ) . Wie zuvor werden für das Protonenleck bei allen Zellen negative Werte gemessen. Maximalatmung und Reserveatmungskapazität steigen durch die Stimulation jeweils auf das 1,7fache der unstimulierten Zellen an und besitzen die größte Differenz zwischen beiden Zellenkulturen (vgl. Tabelle 25 ). Während die prozentuale Reserveatmungskapazität der stimulierten Zellen nur 11,3% höher liegt als die der unstimulierten Zellen, befinden sich beide Kopplungseffizienzen auf einem sehr ähnlich en Niveau (vgl. Tabell e 26 und Abbildung 47 ). Die Stimulation der Zellen führt zu einem höheren BHI (vgl. Tabelle 27 ). Eine Stimulation von PMA – differenzierten Zellen über 24 Stunden führt zu einer mitochondrialen Atmung, die geringer ausfällt als bei den nicht – stimulierten Zellen (vgl. Abbildung 48 ). Somit nehmen auch alle Parameter kleinere Werte an. Der kleinste Untersc hied ist mit 9,39 pmol O 2 /min bei der nicht – mitochondrialen Atmung zu finden. Am weitesten liegend die Werte der Basalatmung auseinander, bei der die stimulierten Zellen nur 55,2% der nicht – stimulierten Zellen betragen (vgl. Tabelle 28 ). Der Unterschied be i der prozentualen Reserveatmungskapazität und Kopplungseffizienz zwischen den beiden Zellkulturen fällt sehr gering aus und beträgt nur 1,1% bzw. 7,1% der Werte der stimulierten Zellen (vgl. Tabelle 29 und Abbildung 52 ) . Im Gegensatz zur mitochondrialen A tmung besitzen die nicht – stimulierten Zellen einen geringeren BHI als die Zellen mit Stimulation (vgl. Tabelle 30 ). 4.3. Fazit Stimulierte und nicht – stimulierte THP – 1 – Suspensionsz ellen zeigen deutliche Unterschiede bei der Betrachtung der vorliegenden Ergebnisse. Ausgehend von der Wachstumskinetik der unstimulierten THP – 1 – Zellen scheint eine Stimulierung der Zellen mit den eingesetzten polymorphen permanenten Magnetfeldern großen E influss auf die messbaren Größen der mitochondrialen Atmung zu besitzen. Nach 84 einer Stunde ist ein Anstieg des OCR zu verzeichnen, dessen stark erhöhte Werte gerade bei der Maximalatmung und der Reserveatmungskapazität sich demnach auf die Einwirkung der K leinschen Felder zurückführen lassen. Diese regen die Zellen an und induzieren eine Reaktion, die ähnlich wie eine Stresssituation eine gesteigerte Aktivität der THP – 1 – Zellen zur Folge hat. Die nicht – mitochondriale Atmung erreicht durch die Stimulation fas t das d oppelte Niveau der nicht – stimulierten Zellen (vgl. Tabelle 7 ), was bedeutet, dass auch sauerstoffverbrauchende Prozesse, die nicht an der Energieproduktion in den Mitochondrien beteiligt sind, unter Vernachlässigung des Wachstums vermehrt ablaufen. Die ATP – Produktion steigt um das mehr als drei fache und liegt nach einer Stunde um das Anderthalbfache höher als bei den Zellen ohne Stimulation (vgl. Tabellen 4 und 7 ). Zusammen mit der stark gestiegenen Maximalatmung resultiert eine hohe Reserveatmungska pazität, die den Schluss zulässt, dass die maximal mögliche Energieproduktion der Mitochondrien durch den Einsatz Kleinscher Felder erheblich gesteigert wird. Durch die kurzzeitige enorme Erhöhung der Aktivität der Zellen kommt es im Verlauf bis vier Stund en zu einem Rückgang der mitochondrialen Atmung, die trotz Wachstum auf ein Minimum heruntergefahren wird. Der starken Beanspruchung der metabolischen Prozesse der Zellen in der ersten Stunde folgt somit eine notwendige Erholungsphase. Nach Erreichen der s tationären Phase bewirkt die Stimulation zwar einen erneuten Anstieg aller gemessenen mitochondrialen Größen, jedoch besitzen diese nach acht Stunden mit dem beispielsweise 1,4fachen der Reserveatmungskapazität nur unwesentlich höhere Werte als die nicht – s timulierten Zellen. In der stationären Phase kann folglich nur noch eine leichte Steigerung der mitochondrialen Atmung durch eine Stimulation mit Kleinschen Feldern erreicht werden. Dies spiegelt sich auch in den Werten nach 24 Stunden wider, die bei den s timulierten Zellen größtenteils nah an denen der unstimulierten Zellen liegen (vgl. Tabelle 17 ). Die Reserveatmungskapazität der nicht – stimulierten THP – 1 – Zellen lässt sich nur schwer in Zusammenhang mit den Wachstumsphasen setzen. Fallende Werte während d es Wachstums und der stationären Phase stehen einer einmaligen Steigerung der Reserveatmungskapazität beim Übergang zwischen den beiden Phasen gegenüber. Die Kopplungseffizienz der unstimulierten Zellen sinkt im Zuge des Zellwachstums und stabilisiert sich nach Erreichen der stationären Phase wieder. Bei den stimulierten Zellen ähneln sich die Verläufe der mitochondrialen Atmung und 85 der Reserveatmungskapazität im Hinblick auf Anstieg und Abfall des OCR. Die Kopplungseffizienz der stimulierten Zellen hingege n spiegelt keine Ähnlichkeit zur mitochondrialen Atmung wieder. Der Vergleich des BHI der THP – 1 – Zellen mit und ohne Stimulation zeigt bei erster Betrachtung eine Abhängigkeit vom Wachstum der Zellen. Ohne Stimulus steigen die Größen der mitochondrialen At mung während der ersten Phase der Vermehrung der Zellen zwar an, jedoch sinkt der BHI. Zurückzuführen lässt sich dies wie bereits beschrieben auf die Kombination der sich unterschiedlich entwickelnden Reserveatmungskapazität, der mitochondrialen ATP – Produk tion, der nicht – mitochondrialen Atmung und des Protonenlecks. Wird die stationäre Phase erreicht steigt der BHI langsam wieder an. Die großen Schwankungen der mitochondrialen Atmung der stimulierten Zellen lassen sich ansatzweise auch beim BHI beobachten. Im Verlauf der ersten Stunde steigt der BHI auf das 1,3fache des Ausgangswertes (1,21; vgl. Tabellen 6 und 9 ) und fällt während der Erholung der Zellen unter diesen. Trotz folgender ansteigender mitochondrialer Atmung sinkt der BHI weiter, bevor er nach 24 Stunden wieder höher liegt als bei den nicht – stimulierten Zellen. Basierend auf diesen Ergebnissen eignet sich eine Auswertung des BHI nur bedingt für die Beurteilung des metabolischen Potentials von Zellen über einen längeren Zeitraum hinweg. Eine Aussag e über die zelluläre Aktivität kann bloß zu einem einzelnen Zeitpunkt während einer Entwicklung getroffen werden. Hinzu kommt der Umstand, dass durch die Bildung von Produkten im Bruch des dekadischen Logarithmus kleine Unterschiede in den Messungen einen viel größeren Einfluss auf das Ergebnis des BHI zur Folge haben. Die Wirkung der Kleinschen Felder auf die PMA – differenzierten Zellen lässt sich nur eingeschränkt beurteilen, da für einen aussagekräftigen Vergleich ein Test für jede Stimulationsdauer mit den Zellen vor und nach der Stimulation hätte durchgeführt werden müssen. Grund ist eine nicht ermittelbare Kinetik der makrophagenähnlichen Zellen, die einzeln angezüchtet wurden. Dennoch kann davon ausgegangen werden, dass die Stimulation mit Kleinschen Feldern für eine und für vier Stunden zu einer Steigerung des mitochondrialen Aktivität geführt ha t, die folglich auch das metabolische Potential der Zellen gesteigert hat. Eine Stimulierung über 24 Stunden hat hingegen einen umgekehrten Effekt und lässt d ie mitochondriale Atmung der 86 Zellen sinken. Während der BHI der Zellen nach einer – und vierstündiger Stimulation mit der mitochondrialen Aktivität korreliert, ist das nach 24 Stunden nicht mehr der Fall. Verantwortlich hierfür ist erneut die Berechnungsgru ndlage des BHI (s.o.). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die permanenten polymorphen Magnetfelder in Form der Kleinschen Felder einen mess – und sichtbaren Einfluss auf die untersuchten THP – 1 – Suspensionzellen und die PMA – differenzierten THP – 1 – Zellen h aben. Eine zeitliche Entwicklung dieser Wirkung kann nur für die in Suspensionskultur wachsenden THP – 1 – Zellen sinnvoll analysiert werden. Die Beurteilung einer sich verändernden Bioenergetik allein anhand des Bioenergetischen Gesundheitsindex‘ (BHI) ist ni cht ausreichend. Die Größen der mitochondrialen Atmung, insbesondere Maximalatmung, mitochondriale ATP – Produktion und Reserveatmungskapazität, eignen sich zur Untersuchung über einen längeren Zeitraum besser, um Aussagen über das metabolische Potential der Zellen treffen zu können. THP – 1 – Zellen, die mit PMA zu adhärenten Zellen ausdifferenziert werden, sind für kontinuierliche Tests mit Kleinschen Feldern eher ungeeignet, da aufgrund ihrer begrenzten Lebenszeit mit ihnen nur eingeschränkt gearbeitet werden kann. Außerdem müssen sie für jeden Versuch neu angezüchtet werden und sind somit abhängig von der Entwicklung der Suspensionskultur der THP – 1 – Zellen. Gerade die Ergebnisse beider Zelltypen nach einer Stunde Stimulation legen die Vermutung nahe, dass durch die Kleinschen Felder die über die mitochondriale Atmung gemessene Aktivität der Zellen erheblich gesteigert werden kann. Dieser Effekt fällt jedoch im Laufe mehrerer Stunden immer geringer aus. Bei einer Wiederholung oder Weiterführung der Versuche sollte beachtet werden, THP – 1 – Zellen nicht länger als bis zur Passage 20 zu nutzen. Stimulationen und Tests mit Zellen aus späteren Passagen lieferten Ergebnisse, die kaum noch Reaktion der Zellen auf die Inhibitoren der Atmungskette zeigten. Außerdem könnten Untersuchungen mit weiteren Zelllinien durchgeführt werden, um eventuelle Unterschiede bei der mitochondrialen Atmung festzustellen. Die Stimulation über verschiedene Zeiträume erfolgte nur von Zel len, die der stetig wachsenden Suspensionskultur entnommen und nach der Untersuchung im Seahorse entsorgt wurden. Interessant wären deshalb Versuche, bei denen Zellen mehrfach stimuliert werden. 87 Literaturverzeichnis Agilent Technologies: Report Generator User Guide. Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. Boujard, Daniel; Anselme, Bruno; Cullin, Christophe; Raguénès – Nicol, Céline; Lechowski, S andra (2014): Zell – und Molekularbiologie im Überblick. Berlin: Springer Spektrum. Chacko, Balu K.; Kramer, Philip A.; Ravi, Saranya; Benavides, Gloria A.; Mitchell, Tanecia; Dranka, Brian P. et al. (2014): The Bioenergetic Health Index. A new concept in m itochondrial translational research. In: Clinical science (London, England : 1979) 127 (6), S. 367 – 373. DOI: 10.1042/CS20140101. Chen, Xiulan; Wei, Shasha; Yang, Fuquan (2012): Mitochondria in the pathogenesis of diabetes. A proteomic view. In: Protein & c ell 3 (9), S. 648 – 660. DOI: 10.1007/s13238 – 012 – 2043 – 4. Franco – Iborra, Sandra; Vila, Miquel; Perier, Celine (2016): The Parkinson Disease Mitochondrial Hypothesis. Where Are We at? In: The Neuroscientist 22 (3), S. 266 – 277. DOI: 10.1177/1073858415574600. Hofmann, Sabine; Bauer, Matthias F. (2005): Mitochondrial Disorders. In: John Wiley & Sons (Hg.): Enzyclopedia of Life Sciences. König, Brigitte (2016): Bioenergetik. Der Goldstandard zur Beurteilung einer mitochondrialen Dysfunktion. In: OM & Ernährung (1 56). Lee, Junghee; Kim, Yunha; Liu, Tian; Hwang, Yu Jin; Hyeon, Seung Jae; Im, Hyeonjoo et al. (2017): SIRT3 deregulation is linked to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. In: Aging cell. DOI: 10.1111/acel.12679. Lemieux, H.; Hoppel, C. L. (2009): Mitochondria in the human heart. In: Journal of bioenergetics and biomembranes 41 (2), S. 99 – 106. DOI: 10.1007/s10863 – 009 – 9211 – 0. Mascotti, K.; McCullough, J.; Burger, S. R. (2000): HPC viability measurement. Trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. In: Transfusion 40 (6), S. 693 – 696. DOI: 10.1046/j.1537 – 2995.2000.40060693.x. 88 Plattner, Helmut; Hentschel, Joachim (2011): Zellbiologie. 4. Aufl. Stuttgart: Georg Thieme Verlag KG. Zong, Wei – Xing; Rabinowitz, Jo shua D.; White, Eileen (2016): Mitochondria and Cancer. In: Molecular cell 61 (5), S. 667 – 676. DOI: 10.1016/j.molcel.2016.02.011.
