Studien > Prof. Dr. Brigitte König – Voruntersuchung – Einfluss von Klein’sche Felder Magnetstreifen auf Mitochondrienfunktion Einfluss von Klein`sche Felder Magnetstreifen auf Mitochondrienfunktionen MMD GmbH & Co KG Einfluss von Klein`sche Felder Magnetstreifen auf Mitochondrienfunktionen Voruntersuchung mit differenzierten THP – 1 Zellen Prof. Dr. Brigitte König 26.02.2014 INHALT Differenzierte THP – 1 Zellen ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 4 Fragestellung ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 4 Methodik ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 4 ZUSAMMENFASSUNG ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 4 Aktivität Mitochondrialer Dehydrogenasen (MTT – Test) ………………………….. ………………………….. ………………… 5 Mitochondriale ATP Generierung ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 8 Mitochondrienmasse ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 10 Mitochondriale s Membranpotential ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 12 Abbildung 1: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in THP – 1 Zellen nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden. Dargestellt ist die Absolutwerte von 4 separaten Analysen und dem Mittelwert. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 5 Abbildung 2: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in THP – 1 Zellen nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt i st der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 6 Abbildung 3: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Deh ydrogenasen in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. …………………. 6 Abbildung 4: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt is t der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 7 Abbildung 5: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen ATP Generierung in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 8 Abbildung 6: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen ATP Generierung in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 9 Abbildung 7: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen A TP Generierung in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 9 Abbildung 8: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Mitochondrienmasse in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 10 Abbildung 9: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Mitochondrienmasse in PBMC nach ein er Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 11 Abbildung 10: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Mitochondrienmasse in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 sepa raten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 11 Abbildung 11: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf das mitochondriale Membranpotential in PBMC nac h einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 12 Abbildung 12: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf das mitochondriale Membranpotential in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert vo n 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ……………….. 13 Abbildung 13: Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf das mitochondriale Membranpotential in PBMC nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 13 DIF F ERENZIERTE THP – 1 ZELLEN FRAGESTELLUNG Die Verwendung von Klein`sche Felder Magnetstreifen in der therapeutischen Anwendung hat Verbesserungen des klinischen Krankheitsbildes gebracht. Der Mechanismus ist nicht gänzlich bekannt, eine direkte und/oder indirekte Wirkung auf die Mitochondrienfunktionen ist anzunehmen. Daher s ollte in einer in – vitro Pilotstudie überprüft werden ob die Anwendung von Klein`sche Magnetstreifen zentrale Mitochondrienfunktionen beeinflusst. METHODIK Es wurde n zunächst mit PMA – differenzierte THP – 1 – Zellen verwendet. Die vorbehandelten THP – 1 – Zelle n wurden in zwei Aliquots geteilt. Jedes Aliquot wurde entweder in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Klein`sche Felder Magnetstreifen bei 37°C unter 5% CO 2 inkubiert. Die Kultivierung in An – bzw. Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen erfolgte für 24 Stunden. Nach der Inkubationszeit wurden die THP – 1 – Zellen der entsprechenden Aliquots entweder mit H 2 O 2 , mit Valinomycin (verursacht Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials) , oder mit Lipopolysaccharid von Escherichia coli (LPS) führt k onzentrationsabhängig zur Mitochondrienschädigung) für weitere 24 Stunden inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Analyse d e r Aktivität en von mitochondrialen Dehydrogenasen, d es mitochondrial generierte n ATP, de s mitochondriale n Membranpotential s und der Mitochondrienmasse . Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Abbildungen dargestellt. ZUSAMMENFASSUNG Insgesamt zeigen die Ergebnisse dass die Anwesenheit von Klein`sche Felder Magnetstreifen die Mitochondrien resistenter gegenüber Stressoren macht. I nsbesondere die mitochondriale ATP Generierung wird durch die Anwesenheit der Klein`sche n Felder Magnetstreifen prinzipiell gesteigert und bleibt auch nach Zugabe von Stressoren signifikant höher im Vergleich zu PMA differenzierten THP – 1 – Zellen in der Abwe senheit der Klein`sche n Felder Magnetstreifen . AKTIVITÄT MITOCHONDR IALER DEHYDROGENASEN (MTT – TEST) Zunächst ist der Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Aktivität der mitochondrialen Enzyme nach 24 Stunden Kultivierung analysiert. Die Aktivität der mitochondrialen Enzyme nach dieser Inkubationsperiode ist in Abbildung 1 dargestellt. Die in Ab – bzw. Anwesenheit von Klein`sche Felder Magnetstreifen kultivierten THP – 1 Zellen wurden ent weder mit H 2 O 2 , mit Valinomycin oder mit LPS für 24 Stunden stimuliert. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 2 bis 4 nachfolgend dargestellt. INSGESAMT ZEIGT SICH , DASS DIE KULTIVIER UNG VON DIFFERENZIERTEN THP – 1 ZELLEN IN GEGENWART DER KLEIN`SCHE FELDER MAGNETSTREIFEN DIE MITOCHONDRIALEN ENZYME AKTIVIERT UND SCHÄDIGENDEN AGE NZIEN SO ENTGEGEN GE WIRKT WIRD. Abbildung 1 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in THP – 1 Zellen nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden . Dargestellt ist die Absolutwerte von 4 separaten Analysen und dem Mittelwert. Nach 24 Stunden Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreifen erhöhten sich die Enzymaktivitäten mitochondrialer En zyme um circa 2 0%. NACH STIMULATION MIT H2O2 Die vorherige Kultivierung der THP – 1 Zellen in Anwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen für 24 Stunden erhöht die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen um mindestens 20% nach Stimulation mit H2 O2 im Vergleich zur Kultivierung in Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen . Abbildung 2 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in THP – 1 Zellen nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. NACH STIMULATION MIT VALINOMYCIN Abbildung 3 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. Die vorherige Kultivierung der THP – 1 Z ellen in Anwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen für 24 Stunden erhöht die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen um mindestens 30 % nach Stimulation mit Valinomycin im Vergleich zur Kultivierung in Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen . NACH STIMULATION MIT LPS Abbildung 4 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen Dehydrogenasen in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimula tion mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. Die vorherige Kultivierung der THP – 1 Zellen in Anwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen für 24 Stunden erhöht die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen um mindestens 30 % nach Stimulation mit LPS im Vergleich zur Kultivierung in Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen . MITOCHONDRIALE ATP G ENERIERUNG INSGESAMT ZEIGT SICH , DASS DIE KULTIVIER UNG VON THP – 1 ZELLEN IN GEGENWART DER KLEIN`SCHE FELDE R MAGNETSTREIFEN DIE MITOCNDRIALE ATP GEN ERIERUNG SIGNIFIKANT STEIGERT. NACH STIMULATION MIT H2O2 Abbildung 5 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen ATP Generierung in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. Die vorherige Kultivierung der THP – 1 Zellen in Anwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen für 24 Stunden erhöht die generierte mitochondriale ATP Menge nach Stimulation mit H 2 O 2 signifikant um mehr als 300% im Vergleich zur Kultivierung in Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen . NACH STIMULATION MIT VALINOMYCIN Abbildung 6 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen ATP Generierung in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert vo n 3 separaten Analysen. Die vorherige Kultivierung der THP – 1 Zellen in Anwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen für 24 Stunden erhöht die generierte mitochondriale ATP Menge nach Stimulation mit VAlinomycin signifikant um mehr als 300% im Vergleich zur Kultivierung in Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen . NACH STIMULATION MIT LPS Abbildung 7 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die mitochondrialen ATP Generierung in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. Interpretation: Tendenziell führt die Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreife n zu einer Höheren ATP Generierung in Gegenwart von Stimulans LPS. Die vorherige Kultivierung der THP – 1 Zellen in Anwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen für 24 Stunden erhöht die generierte mitochondriale ATP Menge nach Stimulation mit LPS signif ikant i m Vergleich zur Kultivierung in Abwesenheit der Klein`sche Felder Magnetstreifen . MITOCHONDRIENMASSE DIE KULTIVIERUNG DER ZELLEN IN GEGENWART DER KLEIN`SCHE FELDER MAGNETSTREIFEN HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUß AUF DIE MITOCHONDRIEN GEMESS EN ALS MITOCHONDRIAL E MASSE. NACH STIMULATION MIT H2O2 Abbildung 8 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Mitochondrienmasse in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. Wasserstoffperoxid führt konzentrationsabhängig zu einer Zerstörung der Mitochondrien und in Folge dessen zu verringerten Massen . Nach 1 Tag Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreifen sind höhere Mitochondrienmassen zu detektieren im Vergleich zu Zellen ohne Einfluß der Klein`sche Felder Magnetstreifen . NACH STIMULATION MIT VALINOMYCIN Abbildung 9 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Mitochondrienmasse in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. In der Regel hat Valinomycin in den eingesetzten Konzentrationen und der gewählten Inkubationsdauer keinen negativen Einfluß auf die mitochondrialen Massen. Nach 1 Tag Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreifen sind die mi tochondrialen Massen vergleichbar unabhängig von der Kultivierung in Anwesenheit von Klein`sche Felder Magnetstreifen . NACH STIMULATION MIT LPS Abbildung 10 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf die Mitochondrienmasse in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. Nach 1 Tag Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreifen sind höhere Mitochondrienmassen zu detektieren im Vergleich zu Zellen ohne Einfluß der Klein`sche Felder Magnetstreifen . MITOCHONDRIALES MEMB RANPOTENTIAL DIE KULTIVIERUNG DER ZELLEN IN GEGENWART DER KLEIN`SCHE FELDER MAGNETSTREIFEN HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUß AUF DAS MITOCHONDRIALE MEMBR ANPOTENTIAL. ES ZEIGT SICH SOGAR, DASS DAS MITOCHONDRIALE P OTENTIAL AUCH IN GEG ENWART VON VALINOMYCIN IM VERGL EICH ZU NICHT DEN KLEIN`SCHE FELDER MAGNETSTREIFEN AUSGESETZTEN ZELLEN LÄNGER STABIL BLEIBT . NACH STIMULATION MIT H2O2 Abbildung 11 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf das mitochondriale Membranpotential in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit H2O2 für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. In der Regel hat Wasserstoffperoxid in den eingesetzten Konzentrationen und der gewählten Inkubationsdauer keinen negativen Einfluß auf das mitochondriale Membranpotential. Nach 1 Tag Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreifen bleibt das mitochondriale Membranpotential auf dem gleichen Niveau im Vergleich zu Zellen ohne Einfluß der Klein`sche Felder Magnetstreifen . NACH STIMULATION MIT VALINOMYCIN Abbildung 12 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf das mitochondriale Membranpotential in PBMC nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden und anschließender Stimulation mit Valinomycin für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. In der Regel hat Valinomycin in den eingesetzten Konzentrationen und der gewählten Inkubationsdauer konzentrationsabhängig einen negativen Einfluß auf das mitochondriale Membranpotential. Nach 1 Tag Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnets treifen hält das mitochondriale Membranpotential höheren Valinomycinkonzentrationen stand. NACH STIMULATION MIT LPS Abbildung 13 : Einfluss der Klein`sche Felder Magnetstreifen auf das mitochondriale Membranpotential in PBM C nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen und anschließender Stimulation mit LPS für 24h. Dargestellt ist der Mittelwert von 3 separaten Analysen. In der Regel hat LPS in den eingesetzten Konzentrationen und der gewählten Inkubationsdauer keinen negativen Einfluß auf das mitochondriale Membranpotential. Nach 1 Tag Kultivierung der Zellen mit den Klein`sche Felder Magnetstreifen bleibt das mitochondriale Membranpotential auf dem höheren Niveau im Vergleich zu Zellen ohne Einfluß der Klein`sche Felder Magnetstreifen .
